Zellkultur-Praxis

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Passagieren[Bearbeiten]

Damit die Zellen stetig wachsen können benötigen sie ausreichend Platz und Nährstoffe. Um dies zu erreichen müssen die Zellen regelmäßig passagiert werden. Dabei wird zuerst das alte Medium durch Absaugen entfernt. Das Medium (in diesem Beispiel) ist ein DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) mit 10 % FKS und 2 % Penicillin/Streptomycin. Da es sich bei den hier verwendeten V79 Zellen um adhärente Zellen handelt müssen sie vor dem Umsetzen abgelöst werden. Dies geschieht durch Trypsin/EDTA (Ethylendiamintetraacetat). Die Bindungen zwischen den Zellen werden gelöst, da einerseits Trypsin die Proteine abbaut und EDTA das für Bindungen benötigte Calcium komplexiert. Nach einmaligem Spülen mit Trypsin zur Entfernung von Mediumrückständen wird ein zweites mal 20 Sekunden mit Trypsin/EDTA geschwenkt und erneut abgesaugt. Nach rund vier-minütiger Inkubation bei 37°C werden die Zellen in 10 ml frischem Medium aufgenommen, von der Platte durch auf- und absaugen abgelöst und in ein Sarstedt-Röhrchen überführt. Dort werden die Zellen vereinzelt, was auch durch mehrmaliges auf- und absaugen geschieht. Nun wird auf 1 ml Volumen eine 1:5 Verdünnung in Medium hergestellt. Diese Verdünnung wird in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt und so die aktuelle Zellzahl ermittelt. Durch Berechnung kann die gewünschte Zellzahl erreicht werden.
Die Zählkammer ist ein relativ dicker Objektträger in den Kreben gefräst wurden. Durch Auflegen eines Deckglases wird so ein genau definierter Hohraum erzeugt. Dieser wird mit der Probe befüllt und anschließend ausgezählt. Betrachtet man die Zählkammer unter dem Mikroskop, kann man insgesamt 8 große Felder, die ihrerseits in 4x4 kleine Felder unterteilt sind erkennen. Um den Zellgehalt in N/mL zu erhalten zählt man min. 4 der großen Felder aus und berechnet die durchschnittliche Zellzahl, durch anschließende Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor VF und der Größe 104 (um auf mL zu kommen):

Man geht davon aus, dass sich die Zellzahl von V79 innerhalb der ersten 24 Stunden einmal verdoppelt und anschließend verdoppelt sich die Anzahl innerhalb von 12 Stunden. Dies entspricht einem Faktor von 8 bei einer Bebrütung von 48 h. Bei einer Zellzahl von 7 * 106 ist bei einer 10 cm Petrischale Konfluenz erreicht und dies versucht man innerhalb des Bebrütungszeitraumes auch zu erreichen. Es werden also = 875.000 Zellen benötigt um innerhalb von 48 h Konfluenz zu erreichen.
Da es noch die Theorie gibt, dass sich die Zellen innerhalb der ersten 24 h gar nicht verdoppeln, sondern sich zunächst an das Medium anpassen müssen, kann es bei der Faktorauswahl (Faktor = 4) zu Variationen kommen. ich schätze das wird auf die Art der verwendeten Zellen ankommen. Also aufpassen und vor Ort informieren.

Um nun das richtige Volumen der benötigten Zellsuspension zu berechnen wird einfach 875.000 durch die Anzahl an Zellen pro mL geteilt. Nun weiß man wie viel der Zellsuspension auf die nächste Platte übertragen werden muss um am Ende der Bebrütung 7*106 Zellen zu erhalten.

Es ist egal ob man in eine Petrischale oder in eine 96Loch-Platte passagiert wird. Man muss nur die entsprechenden Zellzahlen im Blick behalten.