Präparation

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Mikroskopie[Bearbeiten]

Deckglaspräparat[Bearbeiten]

Dies ist die Universalmethode Mikroorganismen unterm Mikroskop zu betrachten.

1) Objektträger reinigen, d.h. in Alkohol tunken und abfackeln
2) Probenbezeichnung seitlich, v.a. sinnvoll wenn man mehrere Proben miteinander vergleichen will
3) Die Öse wird sterilisiert, d.h. in der blauen Bunsenbrennerflamme geglüht und der Stiel wird einmal durchs Feuer gezogen. Die Öse kann entweder am Rande der Agarplatten gekühlt werden, oder bei flüssigem Probenmaterial kann sie i.d.R. direkt eingetaucht werden. Es werden bestimmt nicht alle Mos draufgehen...
4) Probe mischen: Flüssige Proben werden 3 mal gestürzt oder gevortext. Kolonien oder festes Probenmaterial wird mit einer sterilen Öse von der Platte abgenommen und mit Wasser vermischt. (Am einfachsten nimmt man hier Ringerlösung auf Babyflaschen mit denen man Verdünnungsreihen ansetzt. Zum mindestens wenn man welche hat?!)
5) Probe mikrobiologisch öffnen, will heißen bei Flaschen sollte einmal die Deckelöffnung durchs Feuer gezogen werden. Feste Proben auf Agarplatten können einfach geöffnet werden. Vielleicht sollte man darauf verzichten den Deckel übermässig zu bewegen.
6) Probe entnehmen: Je nach KbE 2 - 4 Ösen
7) Das Probengefäß wird schnellstmöglich wieder mikrobiologisch geschlossen, d.h. bei Flaschen wieder die Öffnung durch die Brennerflamme ziehen.
8) Um Verschleppung zu vermeiden wird die Öse nach der Probenentnahme erneut ausgeglüht. Wenn man mehrere Proben auf einmal vorbereitet, ist es sinnvoll evtl. mit mehreren Ösen abwechselnd zu arbeiten.
9) Nun fehlt noch das Deckglas. Dies wird hochkant am Rand des Tropfens abgestellt und dann einfach umgekippt. Evtl mit der Öse noch etwas andrücken.

Solche Präparate werden i.d.R. im Phasenkontrast mit Immersionsöl angeschaut.

Phaskon-Dnkfeld.png
Bewegliche-Sp.png






















Färbepräparat[Bearbeiten]

1) Objektträger reinigen, d.h. in Alkohol tunken und abfackeln
2) Probenbezeichnung seitlich, v.a. sinnvoll wenn man mehrere Proben miteinander vergleichen will
3) Die Öse wird sterilisiert, d.h. in der blauen Bunsenbrennerflamme geglüht und der Stiel wird einmal durchs Feuer gezogen. Die Öse kann entweder am Rande der Agarplatten gekühlt werden, oder bei flüssigem Probenmaterial kann sie i.d.R. direkt eingetaucht werden. Es werden bestimmt nicht alle Mos draufgehen...
4) Probe mischen: Flüssige Proben werden 3 mal gestürzt oder gevortext. Kolonien oder festes Probenmaterial wird mit einer sterilen Öse von der Platte abgenommen und mit Wasser vermischt. (Am einfachsten nimmt man hier Ringerlösung auf Babyflaschen mit denen man Verdünnungsreihen ansetzt. Zum mindestens wenn man welche hat?!)
5) Probe mikrobiologisch öffnen, will heißen bei Flaschen sollte einmal die Deckelöffnung durchs Feuer gezogen werden. Feste Proben auf Agarplatten können einfach geöffnet werden. Vielleicht sollte man darauf verzichten den Deckel übermässig zu bewegen.
6) Probe entnehmen: Je nach KbE 1 - 2 Ösen
7) Das Probengefäß wird schnellstmöglich wieder mikrobiologisch geschlossen, d.h. bei Flaschen wieder die Öffnung durch die Brennerflamme ziehen.
8) Die Probe wird nun dünn ausgestrichen. Feste Proben kann man mit einem Deckglas schön flach ausstreichen.
9) Um Verschleppung zu vermeiden wird die Öse nach der Probenentnahme erneut ausgeglüht. Wenn man mehrere Proben auf einmal vorbereitet, ist es sinnvoll evtl. mit mehreren Ösen abwechselnd zu arbeiten.
10) Probenauftrag trocknen, an der Luft! Sonst springt manchmal der Objektträger
11) Probenauftrag fixieren, will heißen Objektträger wird 3 mal durch den blauen Teil der Brennerflamme ziehen
12) Die fixierte Probe kann mit Methlenblau (MB) oder mit Toluolblau (T) eingefärbt werden. (2 - 3 Tropfen)
13) Einwirkzeit: MB 3 Min. und T 10 - 20 sek
14) Der Überschuß wird abgespült
15) Luft trocknen oder vorsichtig an der Brennerflamme trocknen

Mikroskopie: Im Hellfeld mit einem 100er Objektiv und Immersionsöl betrachten


Staebchen.png

Tesafilmpräparat[Bearbeiten]

Ein Tesafilmpräparat wird bevorzugt mit Schimmeln gemacht.

1) Objektträger reinigen
2) 1 Tr. Anilinblau/Lactophenolblau auftragen 3) Aus einem 3 - 4 cm langem Teasstück kann zwischen Daumen und Zeigefinger eine Schlaufe geformt werden (Klebeseite nach außen).
4) Nun mit der Klebeseite zum Beispiel die Oberfläche eines Camenbertkäse leicht berühren. Am besten nicht mit dem Finger draufdrücken, da sonst der Fruchtstand gequetscht wird und nicht mehr so gut erkennbar ist.
5) Last but not least den Streifen auf den Objektträger kleben.

Mucor-Köpfchen.jpeg

Gram Färbung[Bearbeiten]

Gram+e und Gram-e haben einen Hauptunterschied: ihre Zellwand. Diesen Unterschied kann man nutzen, sodass die Mikroorganismen mikroskopisch unterscheidbar werden.

Bei der Färbung wechselwirken Anilinfarbstoffe mit Iod und bilden einen blaugefärbten Komplex. Bei Gram+en kann der Komplex nicht mehr mit Entfärbern (Alkohol und Aceton) entfernt werden und der blaue Farbstoff verbleibt in der Zellwand. Dies liegt daran, dass sich durch Alkohole die Peptidoglykanschichte dehydriert werden und sich so die Poren verschließen. Bei Gram-en hingegen kann der Komplex entfernt werden und die Zelle durch eine Gegenfärbung mit Karbolfuchsin rot oder mit Safraninlösung orange gefärbt werden. Einfach zu merken: Negative Zahlen werden in der Finanzwelt auch immer als rote Zahlen dargestellt.

Färbeset:
Natürlich gibt es fertige Sets die folgende Reagenzien enthalten:
Lösung 1: Kristallviolett
Lösung 2: Lugols Lösung
Lösung 3 und 4: Entfärberlösung
Lösung 5: Safraninlösung


Durchführung:
1) Zuerst wird der Objektträger entkeimt und entfettet (i.d.R mit Alkohol).
2) Nun werden die Bakterien auf den Objektträger aufgetragen und vorsichtig getrocknet (fixiert)
3) Die fixierten Ausstriche werden nun mit Kristallviolett bedeckt. Nach einer Einwirkzeit von 1 min kann weitergehen.
4) Das Kristallviolett kann abgegegossen werden und anschließend wird mit Lugolslösung nachgewaschen.
5) Nun wird der Objektträger mit Lugolslösung bedeckt und erneut 1 min gewartet.
6) Anschließend wird mit Wasser gewaschen.
7) Die Safraninlösung muss ebenfalls 1 min einwirken
8) Ein letztes Mal mit Wasser waschen und trocknen lassen

Das Präparat wird bevorzugt mit 1000 facher Vergrößerung und Immersionsöl angeschaut.


Aminopeptidase-Test[Bearbeiten]

Auch wenn dieser Test eher unzuverlässig ist soll er hier erwähnt werden. Die Aminopeptidas E.C.3.4.11 kommt fast ausschließlich in Gram negativen Bakterien vor. Ein Filterpapier, welches mit dem Testsubstrat L-Anilin-4-nitroanilid imprägniert wurde, wird auf die zu untersuchende Kolonie gelegt. Innerhalb von 5 Min sollte um die Gram negativen Keime eine Gelbfärbung durch freigesetztes p-Nitroanilin zu sehen sein. Man sollte aber beachten, dass Nitroaniline giftig sind und spontane Entzündungen hervorrufen können.

Sporenfärbung[Bearbeiten]

Die Sporenfärbung wird angewendet um Mikroorganismen und ihre Sporen von anderen Begleitstoffen zu unterscheiden. Dieses Verfahren ist für eine Keimzahl von 104 KbE. Das Präparat wird im Hellfeld mit 1000 facher Vergrößerung unter dem Mikroskop betrachtet.

Durchführung: 1) Das Probenmaterial wird auf einem gereinigten Objektträger fixiert, d.h. es wird mit einer Impföse Probenmaterial auf den Objektträger gegeben evtl etwas mit einem Deckglas verteilt und luftgetrocknet. Sobald es trocken ist, wird es noch 3 mal zügig durch die Brennerflamme gezogen.
2) Anschließend wird die fixierte Probe mit einem Filterpapier, auf dem sich 3-4 Tropfen Malachitgrün-Lösung befinden, abgedeckt.
3) 5 min lang den Objektträger alle 3 sek durch die nichtleuchtende Brennerflamme ziehen. (Eventuell sollte man vielleicht zwischendurch neue Farbe auftropfen.)
4) Nun wird das Filterpapier entfernt und der Objektträger mit Wasser gespült. Man sollte hier vielleicht etwas langsam machen^^ Es soll schon vorgekommen sein, das es einen Objektträger vor Schock zerlegt hat ;-)
5) Nachdem man den Objektträger vorsichtig mit einem Filterpapier getrocknet hat, wird noch 30 sek mit Safraninlösung gefärbt.
6) Farbe abwaschen, trocknen, ankucken

Die Sporen werden durch die Malachitgrün-Lösung *trommelwirbel* grün gefärbt.^^ Die vegetativen Zellen werden durch die Safraninlösung rot gefärbt.

Anmerkung:
Hat man ein Phasenkontrastmikroskop kann man sich teilweise die Färbung sparen. Die Sporen sind stark lichtbrechend und leuchten im Phasenkontrast hell auf. Aber vorsicht: Manchmal sieht man auch nur Dreck. Der leuchtet auch manchmal hell ;-)

Anzucht[Bearbeiten]

Plattengußverfahren[Bearbeiten]

Hier gibt es 2 Möglichkeiten: Entweder wurden die Proben bereits im Voraus in die Petrischalen pipettiert und dann wird der Agar darüber gegossen und durch achterförmige Bewegungen wird alles dann vermischt. Es gibt aber auch die Möglichkeit, das den Proben in Peptonlösung etwas Agar hinzugefügt und durch Schwenken vermischt wird. Anschließend werden die Probefläschchen komplett in eine Petrischale entleert. In beiden Fällen müssen die Platten erst auskühlen, bevor sie bebrütet werden. Dabei wird der Agar fest.
Man sollte nur beachten, dass der Agar nicht zu heiß ist. Einerseits können empfindliche MOs durch ein zu heißes Medium abgetötet werden, andererseits steigert sich auch das Kondenswasser je wärmer der Agar ist. Diese Tatsache könnte die Auswertung erschweren. Man kann aber vor dem Zählen mit dem Finger auf die Petrischale klopfen, dann läuft das Kondenswasser meist zusammen.
Kleine Petrischalen werden meist überkopf bebrütet. Bei großen Petrischalen funktioniert dies meist nicht, da hier die Schwerkraft den Nährboden aus der Petrischale ziehen würde.
Bei mehr als 300 koloniebildenden Einheiten (KbE) ist das auszählen meist schwierig, also sollten bei hohen Keimzahlen auf Verdünnungsreihen zurückgegriffen werden.

Anaerobe[Bearbeiten]

Anaerobe Keime müssen unter Luftabschluß herangezüchtet werden. Hierfür kann man entweder einen Anaerobiertopf oder Reagenzgläser benutzen.

Variante A: Anaerobiertopf
Die Proben werden ganz wie auch immer (Plattenguß, Ausstrich etc) auf Platten verteilt. Anschließend werden die Platten in ein Glasgefäß, das wie ein Exikator aussieht, eingestellt. Im Handel werden sog. Gas-Packs vertrieben, die nur etwas mit Wasser befeuchtet werden müssen. Ein solches Gas-Pack wird mit hinzugegeben und der Anaerobiertopf anschließend geschlossen. Das Päckchen enthält chemische Substanzen, die der Luft den Sauerstoff entziehen und in CO2 umwandeln. So kann eine komplett sauerstofffreie Atmosphäre geschaffen werden.
Warum kann man da nicht einfach einen Exikator verwenden und diesen evakuieren?, fragt sich der schlaue Fuchs der Geld sparen will.
Diese Methode ist aus einem großen und mehreren kleinen Gründen ungeeignet. Zum einen ist es ein großes Problem den Exikator 100%ig zu evakuieren, und es würden Sauerstoffreste verbleiben die sehr empfindliche MOs am Wachsen behindern könnten. Zum anderen muss man mit Vakuum arbeiten, dabei kann es im dümmsten anzunehmendem Fall auch mal einen verreißen. Fliegendes Glas ist nicht so geil. Kurz gesagt es ist einfach viel viel zu umständlich.

Variante B: Reagenzglas
Man kann einfach die Keime mit Agar vermischt in Reagenzgläser abfüllen und nach Erstarren des Agars eine Schicht Parafin drübergießen. Dieses erstarrt dann auch nach kurzer Zeit und der Agar ist luftdicht abgeschlossen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass man Gasentwicklung erkennen kann. Wenn die Keime Gase produzieren hebt sich durch den ansteigenden Druck der Parafindeckel etwas an.

Reagenzglas[Bearbeiten]

Beispiel 1: Man kann E.coli und andere Fäkalkeime in Wasser und Milch mit der sog. Brila-Bouillon nachweisen. Bei der Brillantgrün-Galle-Laktose-Bouillon handelt es sich um ein flüssiges Nährmedium. Dem Reagenzglas wird noch ein Durham-Röhrchen hinzugefügt und das ganze kommt für 2 Tage bei 30°C in den Brutschrank. Ein Durham-Röhrchen ist eine Art Minireagenzglas (3 cm), das mit der Öffnung nach unten in das Reagenzglas gegeben wird und so von den Mikrorganismen gebildetes Gas auffangen kann. Ist die Menge an gebildetem Gas groß genug steigt das Röhrchen an die Obfläche der Brilalösung.
Brillantgrün und Galle hemmen die unerwünschte Begleitflora. Laktose wird unter Gasbildung von den coliformen Keimen vergärt.

Oberflächenausstrich[Bearbeiten]

Drigalskispatel.png

Hier wird das Untersuchungsmaterial auf einer im Voraus gegossenen Platte mit einem abgeflammten Drigalskispatel ausgespatelt. Es kann ein maximales Volumen von 0,1 mL ausgespatelt werden, da die Platte nicht mehr ausnehmen kann. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass man einfacher Kolonien für einen Reinigungsausstrich abnehmen kann als beim Plattengußverfahren. Der Drigalskispatel ist ein gebogener Metalbügel (vgl. Abb.). Er wird meist in Ethanol getaucht und dann angezündet um ihn zu Sterilisieren. Nachdem er abgekühlt ist, kann dann mit dem waagrechten Teil unten vorsichtig über die Agarplatte gestrichen, also ausgespatelt, werden.

Reinigungsausstrich.png

Reinigungsausstrich[Bearbeiten]

Der Reinigungsausstrich, auch Refraktionierter Ausstrich genannt, hat den Zweck Kolonien zu vereinzeln und voneinander zu trennen. Hat man beispielsweise auf einem Kollektivnährboden eine Probe kultiviert in der sich mehrere unterschiedliche Organismen befinden, wachsen diese meist kreuz und quer auf der ganzen Platte. Mit einem Reinigungsausstrich kann man diese Kolonien separieren um sie einer Differenzierung zu unterziehen, ohne aus Versehen 2 unterschiedliche Keime zu vermischen.
Je nach Problemstellung kann es sinnvoll sein einen Selektivnährboden zu verwenden, um eine unerwünschte Begleitflora gleich im Keim zu ersticken.
1) Impföse ausglühen. Man kann sie schnell abkühlen, indem man sie in eine unbenutzte Stelle des Agars drückt. Mit der abgekühlten Öse nimmt man (wenn möglich) eine der Kolonien auf, die man ganauer untersuchen möchte. Diese verteilt man wie in der Abbildung (unter 1) zu sehen auf der Agarplatte. Es wird die Oberfläche nur berührt und nicht eingetaucht!
2) Die Impföse wird erneut ausgeglüht, um überschüssiges Probenmaterial zu entfernen. Öse abkühlen. Ohne erneut Probenmaterial aufzunehmen zieht man nun im 90° Winkel erneut über die ersten Impflinien. Vgl Punkt (2) der Abbildung.
3) Öse ausglühen und abkühlen. Nun wird ein drittes Mal das Probenmaterial vereinzelt.

Ob man sich für die linke oder die rechte Auftragsweise entscheidet macht eigentlich keinen Unterschied. Man sollte sich evtl. über die Gepflogenheiten vor Ort informieren.
Man muss auch aufpassen wie stark man die Öse auf die Agarplatte aufsetzt. Es passiert leicht, das man mit zu viel Druck arbeitet und so die Agarplatte mit der Öse aufgeschlitzt wird. Dies sollte möglichst vermieden werden.