MTT-Test

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Grundlagen[Bearbeiten]

Im Rahmen dieses Versuches wurde untersucht, ab welcher Menadionkonzentration eine cytotoxische Wirkung eintritt. Dies wurde über den MTT-Test ermittelt:

Der MTT-Test stellt eine Möglichkeit dar, die Lebensfähigkeit von Zellen zu untersuchen. Dies geschieht durch eine Reaktion des MTT-Farbstoffes 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Dieser wird von Zellen mit Stoffwechselaktivität (grob: le- benden Zellen) aufgenommen und durch Dehydrogenasen zu einem blauen Formazan reduziert. Die Bildung des Formazans korreliert mit der mitochondrialen Zellatmung und ist somit ein Vitalitätsparameter. Problematisch bei diesem Test ist jedoch, dass Vitalität, also Teilungsfähigkeit, nur durch eine Wachstumskurve nachgewiesen werden kann. Dies wäre allerdings (in unserem Fall) zu langwierig. So wird hier die Stoffwechselaktivität der Zellen getestet.

Durchführung[Bearbeiten]

Für den Test wurden die Zellen unterschiedlich lang mit unterschiedlichen Menadion-Konzentrationen inkubiert, um die Cytotoxizität von Menadion zu ermitteln. Die Inkubationszeiten reichten von 3 bis 6 Stunden. Zuerst wurde eine Verdünnungsreihe mit Konzentrationen von Menadion von 0,2 mM bis 20 mM hergestellt. Die Verdünnungen wurden in 100 % DMSO (Dimethylsulfoxid) angesetzt.
Am Tag der Inkubation wurden für jede Platte direkt vor der Inkubation aus der Verdünnungsreihe die Inkubationslösungen hergestellt. Hierbei wurden 1,99 mL Medium vorgelegt und jeweils 10 μL der Verdünnung zugegeben. Somit wurden Menadionkonzentrationen von 1 - 100 µM erreicht. Jede Inkubationslösung hatte nun nur noch eine DMSO-Konzentration von 0,5%. Zwei Negativkontrollen wurden mit 0,5 %-iger DMSO in Medium durchgeführt Diese DMSO-Lösung wurde auch in eine weitere Reihe einpipettiert, hier wurden keine Zellen eingesät. Eine Stunde vor Ablauf der Inkubationszeit wurde die MTT-Lösung zugegeben (jeweils 20 µL mit 50 mg MTT auf 10 mL PBS). Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das Medium abgesaugt, 100 µL Lysepuffer (5 g SDS, 0,3 mL Eisessig, 49,7 mL DMSO) zugesetzt. Die 96Loch-Platten wurden mit dem SPECTRAFluor photometrisch bei 570 nm nach fünf-minütiger Schüttelphase dreifach gemessen. Die erhaltenen Daten wurden gemittelt. Um eine optimale Messung zu gewährleisten, sollte beim Beimpfen der 96Loch-Platte darauf achten, dass keine 2 abgestuften Konzentrationen nebeneinander einpipettiert werden. Also nicht der Reihe nach: 1, 2, 5, 10 ... 100. Sondern wie der Tabelle zu entnehmen ist, sollte alles durcheinander einpipettiert werden. Das macht die Auswertung zwar umständlicher und es kann bei dem Haufen Zahlen leicht was durcheinander geraten, aber die Messung liefert bessere Ergebnisse.

Beispiel-Auswertung[Bearbeiten]

Es wurde zunächst ein Ausreißer-Test nach Grubbs mit einem Signifikanzniveau von 5% durchgeführt. Die Ausreißer sind mit einem Sternchen in der Tabelle markiert und wurden bei der Auswertung nicht berücksichtigt. Anschließend wurden die Mittelwerte der gemessenen Extinktionen in ein prozentuales Verhältnis zu den Mittelwerten der Reihen 3 und 12 gesetzt und die Ergenisse gemittelt. Es wurde mit Excel ein Säulendiagramm erstellt.


Konz. Menadion 25 100 DMSO 12,5 50 2 Negativ 10 5 20 1 DMSO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,0897 0,0806 0,2544 0,1469 0,0965 0,2598 0,0706 0,2096 0,2685 0,1100 0,2896 0,3394
B 0,0961 0,0746 0,2539 0,1492 0,0934 0,2819 0,0683 0,2077 0,2728 0,1016 0,2646 0,2835
C 0,0956 0,0760 0,2614 0,1473 0,0902 0,2591 0,0637 0,2181 0,2782 0,1039 0,2466 0,2860
D 0,0958 0,0790 0,2356 0,1465 0,0854 0,2568 0,0767 0,2010 0,2693 0,0987 0,3125 0,3760
E 0,1154 0,0758 0,2485 0,1468 0,1000 0,2697 0,0698 0,2103 0,2910 0,1119 0,2774 0,2498
F 0,1177 0,0730 0,2648 0,1501 0,0904 0,2703 0,0674 0,1998 0,2847 0,1032 0,2855 0,2875
G 0,1113 0,0756 0,2678 0,1543* 0,0901 0,2654 0,0700 0,1981 0,3109* 0,1035 0,2427 0,1514
H 0,1070 0,0781 0,2465 0,1462 0,0867 0,2481 0,0760 0,2060 0,2710 0,0915 0,2823 0,3212
Mittelwert 0,1036 0,0766 0,2541 0,1476 0,0916 0,2639 0,0703 0,2063 0,2765 0,1030 0,2752 0,2869
MW - Negativ 0,0333 0,0063 0,1838 0,0773 0,0213 0,1936 0,0000 0,1360 0,2062 0,0327 0,2049 0,2166
Standardabweichung 0,0106 0,0025 0,0106 0,0015 0,0049 0,0103 0,0043 0,0066 0,0086 0,0063 0,0231 0,0672
Rel. Viabilität bezügl. R.3 17,95% 3,43% / 42,06% 11,59% 105,33% / 73,99% 112,19% 17,79% 111,48% /
Rel. Viabilität bezügl. R.12 15,24% 2,91% / 35,69% 9,83% 89,38% / 62,79% 95,20% 15,10% 94,60% /
Mittelwert 16,60% 3,17% / 38,88% 10,71% 97,36% / 68,40% 103,70% 16,44% 103,04% /
Konz. Menadion 25 100 DMSO 12,5 50 2 Negativ 10 5 20 1 DMSO


MTT-Test-gesamt.jpeg