HPLC

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Einleitung[Bearbeiten]

Die HPLC-Methode entstand in den 60er Jahren und wurde bis heute immer weiterentwickelt. Aus der High-Pressure-Liquid-Chromatographie wurde in den 70ern die High-Performance-Liquid-Chromatographie. Seit den 80er Jahren ist sie verstärkt in der Analytik im Einsatz, hauptsächlich mit UV-, DAD- oder Fluoreszens-Detektoren gekoppelt. Die HPLC kann aber auch mit einem Massenspektrometer gekoppelt werden (sog. LCMS).

Niederdruckanlage

Das Analysat wird mithilfe eines Eluenten (mobile Phase) zu einer Trennsäule gebracht. Dies ist die stationäre Phase, die sehr häufig aus Kieselgel bzw. Kieselgelmodifikationen besteht. Die Modifikationen sind in der Regel funktionelle Gruppen an der Oberfläche des Kieselgels, an welche sich die zu bestimmenden Komponenten des Analysaten binden können. Die Substanzen werden unterschiedlich lang von den Gruppen gebunden und können so aufgetrennt werden. Durch geeignete Auswahl von mobiler und stationärer Phase ergeben sich verschiedene Trennmechanismen: z.B. Adsorption durch vdW-Kräfte oder Ionenaustausch. Durch die individuelle “Haftdauer” der Komponenten verlassen sie die Säule nach unterschiedlichen Zeiten (sog. Retentionszeiten). Ein nachgeschalteter Detektor erfasst die Probekomponenten und gibt die Ergebnisse an einen Rechner weiter, der dann ein Chromatogramm ausgibt. Die Anzahl der Komponenten gibt die Anzahl der Peaks vor, zumindest in der Theorie. Häufig kann es auch paaieren, dass Substanzen gleichzeitig die Säule verlassen und Peaks so zusammen fallen. Oder einige Substanzen so gering konzentriert sind, im Gegensatz zu anderen, dass sie nur als kleine Beule vor oder nach einem großen Peak zu sehen sind. Da muss man dann an der Elution puzzeln, bis man ein geeignetes Trennprogramm entwickelt hat.

Aussage eines Chromatogramms[Bearbeiten]

HPLC mit UV-Detektion: Jeder Peak entspricht einer Substanz, die sich in der Probenlösung befunden hat.

Qualitativ[Bearbeiten]

Die Retentionszeit (tr) einer Substanz, also die Zeit die vom Einspritzen bis zur Detektion vergeht, ist für jede Substanz bei gleichen Bedingungen immer gleich lang. Mit Bedingungen sind die HPLC-Parameter gemeint, also Trennsäule (Material und Länge), Eluent, Fließgeschwindigkeit, Probenvolumen und Temperatur.

Zur Identifizierung werden Standardlösungen der Reinsunstanzen hergestellt und analysiert. Die Retentionszeiten der Standards sind gleich der Retentionszeiten der Komponenten in der Probe. Ein DAD-Detektor erlaubt noch die Identifizierung anhand des UV-Spektrums.

Quantitativ[Bearbeiten]

Um quantitative Aussagen mit einem Chromatogramm zu machen zieht man i.d.R. die Fläche unter dem Peak heran. Durch interne oder externe Standards können dann die zu bestimmenden Komponenten quantifiziert werden. Man erstellt normalerweise eine Kalibriergerade aus 5 Punkten. Über die Geradengleichung kann dann die Konzentration aus der Fläche berechnet werden.

Berechnung wichtiger Größen[Bearbeiten]

Für HPLC-Säulen, die immer wieder wechselnden Bedingungen ausgesetzt sind ist es wichtig, dass die Qualität der Säule laufend uberprüft wird. Dabei wird ein Testgemisch eingespritzt und aus den entstehenden Peaks die Bodenzahl und Permeabilität der Säule ermittelt. Da die Retentionszeit von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten abhängt, ist es günstiger den Retentionsfaktor k zu bestimmen.

(wobei der Totzeit entspricht)

Die Totzeit wird uber eine nicht retardierende Substanz, in unserem Fall Uracil (vgl. Säulentests), bestimmt. Der Retentionsfaktor ist nur indirekt von der Säulenlänge und der Fließgeschwindigkeit abhängig. Retentionsfaktoren zwischen 1 und 10 sind optimal.

Ist k<1 ist die Trennung evtl. ungenügend. Je größer k ist, desto länger dauert die Analyse.

2 Komponenten werden nur dann sauber getrennt, wenn sich ihre k-Werte bzw. ihre Retentionszeiten deutlich von einander unterscheiden.

Als Maß für eine saubere Trennung zieht man den Trennfaktor heran, er zeigt somit die Selektivität der Trennung an.

Ist = 1 gibt es keine Trennung. Eine Änderung der mobilen bzw. der stationären Phase bewirkt eine Änderung des Trennfaktors.


Ein weiteres Kriterium zur Beurteilung der Trennung ist die Auflösung R.

ist die Breite des Peaks auf halber Höhe.

Ist R = 1 ist eine vollständige Trennung zweier Peaks nicht gegeben. Man kann evtl. 2 Spitzen erkennen, doch quantifizieren lassen sie sich nicht. Für eine Quantifizierung ist eine Basislinientrennung notwendig, d.h. R ≈ 1,5.

Des Weiteren kann man die Anzahl der theoretischen Böden N, also die Andockmöglichkeiten an der stationären Phase, ermitteln.

Streng genommen gilt diese Formel nur für absolut Gaus-förmige Peaks, die aber eine Seltenheit sind.

Aus der Säulenlänge L und der Bodenzahl N ergibt sich die Bodenhöhe H.

H ist also die Strecke auf der sich einmal ein Gleichgewicht einstellt.

Fronting und Tailing[Bearbeiten]

In vielen Fällen weisen die Peaks der Chromatogramme nicht Gaus-Verteilung auf. Häufig erkennt man eine Verbreiterung der rechten Hälfte des Peaks. Was als Tailing bezeichnet wird. Starkes Tailing weist daraufhin, dass die Trennung nicht optimal ist. Die Anzahl der theoretischen Böden ist verringert.

Fronting sieht man relativ selten. Hier ist auf der linken Seite des Peaks ein Buckel zu sehen.


Säulentest[Bearbeiten]

Hier mal zwei unterschiedliche Säulenlängen im Vergleich: Zuerst wurde eine 25 cm lange C18(2)-Säule getestet. Im Anschluss eine 12,5 cm lange Säule des gleichen Typs.

Lange Säule[Bearbeiten]

Die Parameter des Säulentests:

  • LUNA C18(2)-Säule; 250 x 4,6 mm; 5 m Teilchen; Hersteller Phenomenex
  • Eluent: Wasser/Acetonitril (75/25)
  • Fluss: 1 mL/min
  • Injektionsvolumen: 1 µL
  • UV-Detektion bei 254 nm

Folgende Werte wurden dabei aus den Retentionszeiten ermittelt: (Um besser unterscheiden zu können aus welchen k- bzw. -Werten sich α und R zusammensetzen, habe ich das in der Tabelle in Kurzform vermerkt)

Die Peaks von oben nach unten gehören zu 1) Uracil 2) Benzamid 3) Benzol 4) Benzophenon 5) Biphenyl.

Saeulentest-lang.jpg
1 2 3 4 5
2,281 2,655 5,264 6,175 9,336
k =t0 0,164 1,308 1,707 3,093
0,070 0,073 0,105 0,122 0,171
N 5883 7328 13924 14193 16514
H 0,042 0,034 0,018 0,018 0,015
× k3 /k2 = 7,976 k4 /k3 = 1,305 k5 /k4 = 1,812 ×
= 3,09 = 17,3 = 4,7 = 12,73 ×
Kurze Säule[Bearbeiten]

Die Parameter des Säulentests:

  • LUNA C18(2)-Säule; 125 x 4,6 mm; 5 m Teilchen; Hersteller Phenomenex
  • Eluent: Wasser/Acetonitril (75/25)
  • Fluss: 1 mL/min
  • Injektionsvolumen: 1 µL
  • UV-Detektion bei 254 nm
Saeulentest-kurz.jpg
1 2 3 4 5
1,506 1,747 2,648 3,056 4,047
k = t0 0,16 0,76 1,03 1,69
w1/2 0,062 0,066 0,075 0,086 0,102
N 3269 3882 6906 6996 8721
H 0,038 0,032 0,018 0,018 0,014
× k3 /k2 = 4,75 k4 /k3 = 1,36 k5 /k4 = 1,64 ×
= 2,22 = 7,54 = 2,99 = 6,22 ×
Unterschiede durch die Säulenlänge[Bearbeiten]

Was sagt uns nun der Vergleich der beiden Säulentests bzw. der beiden Säulen? Wie man den Abbildungen schon intuitiv entnehmen kann ist die Auftrennung bei der kurzen Säule zwar noch gut erkennbar, aber die Peaks sind nicht Basislinien-getrennt und es wirkt alles ziemlich gedrungen.

Die ermittelten Werte zeigen, dass die Trennung ungenügend ist. Die lange Säule weist z.B. nur einen k-Wert unter 1 auf, die kurze hat schon 2 k-Werte < 1, der 3. k-Wert ist ungefähr gleich 1. Die Anzahl der theoretischen Böden ist bei der 25 cm-Säule ungefähr doppelt so hoch, was eine bessere Trennung ermöglicht. Die Höhe der Böden ist bei beiden Säulen vergleichbar.

Der Integrator gibt noch den Typ der Flächenberechnung aus. Bei der langen Säule wird bei den Peaks 3,4 und 5 BB und bei den Peaks 1 und 2 BP bzw PB angegeben (vgl. Abb lange Säule). Was auf eine relativ ordentliche Berechnung (BB=Baseline/Baseline) also auf eine ordentliche Trennung hinweist. Bei der kurzen Säule werden alle möglichen Berechnungstypen (BH,SHB,SPB und ISPP, vgl. Abb kurze Säule) ausgegeben, was auf eine unsaubere Trennung der Peaks hinweist. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte man v.a. für quantitative Analysen die lange Säule verwenden, da hier eine bessere Trennwirkung (auf Kosten der Zeit) erzielt werden kann. Eine kurze Säule bietet Vorteile, wenn die einzelnen Komponenten ausreichend weit von einander eluieren, da liefert eine kurze Säule schnellere Trennungen.

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Van-Deemter-Gleichung[Bearbeiten]

Abgesehen von den HPLC-Parametern (= Trennsäule, Eluent, Fluß, Probenvolumen und Temperatur) beeinflussen noch andere Prozesse die Trennung. Sie sind von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten abhängig und werden in der van-Deemter-Gleichung zusammengefasst.

Van-Deemter Beziehung

Die schwarze Kurve zeigt die Höhe H der theoretischen Böden, die blaue Gerade entspricht dem Stoffaustausch C, die grüne Gerade entspricht der Eddy-Diffusion A und die rote Kurve der Diffusion B. Die daraus resultierende H(u)-Funktion zeigt ein Minimum bei einer bestimmten Fließgeschwindigkeit u der mobilen Phase. In diesem Minimum ist die Höhe der theoretischen Böden am kleinsten, d.h. die Anzahl der Böden ist dort am größten. Im Minimum ist die Stärke der Trennung am größten, d.h. auch das die Peaks schmaler werden.

Die Eddy-Diffusion A beschreibt die Verbreiterung der Probenzone durch mechanische Widerstände, die die Säule der mobilen Phase und den Probekomponenten entgegensetzt. Die einzelnen Komponenten bewegen sich auf unterschiedlichen Wegen durch die Säule, was alleine schon zu unterschiedlichen Austrittszeiten aus der Säule führt. Dieses Phänomen bewirkt eine Peakverbreiterung. A ist unabhängig von u.

Die Diffusion B, auch Longitudinaldiffusion genannt, beschreibt die Teilchenbewegung, die infolge des Konzentrationsgefälles auftreten. Durch eine hohe Fließgeschwindigkeit wird dieser Einfluss minimiert, da er zeitabhängig ist.
Dieser Term hat einen starken Beitrag, wenn hohe Diffusionskoeffizienten in der mobilen Phase vorliegen.
Für die HPLC ergibt sich folgendes: Da sich die Moleküle in einer flüssigen mobilen Phase nicht so schnell bewegen können wie in Gasen sind hier die Diffusionskoeffizienten relativ gering. Und da B proportional zum Diffusionskoeffizienten ist hat er bei der HPLC nur geringe Bedeutung. In der GC ist dies anders: Hier ist der Diffusionskoeffizient i.d.R. um 4 Größenordnungen höher als in Flüssigkeiten und hat somit einen sehr starken Einfluss auf die Peakverbreiterung.

Im Gegensatz dazu ist der C-Term proportional zu . Der Einfluss auf HPLC und GC dieses Terms ist genau umgekehrt wie der B-Term.

Der Stoffaustausch C beschreibt nun die eigentliche chromatographische Trennung. Die Zahl und die Intensität der Wechselwirkungen der Komponenten mit der stationären Phase wirkt sich auf die Retentionszeiten aus, sodass eine vollständige Peaktrennung erreicht werden kann. Aber die Faktoren A und B wirken dieser Trennung entgegen, da sie eine Rückvermischung bewirken. Der Stoffaustausch benötigt eine gewisse Zeit, sodass gering Fließgeschwindigkeiten zu einer besseren Trennung führen. Dies bewirkt aber eine größere Diffusion.


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Aufbau einer HPLC[Bearbeiten]

Arbeitsweisen[Bearbeiten]

Man kann HPLC-Anlagen je nach Trennproblem auf 2 Arten betreiben:

Isokrat[Bearbeiten]

Hier wird ein festes Gemisch verwendet. Häufig Wasser plus einen prozentualen Anteil an MeOH oder ACN. Die Wechselwirkungen zwischen Eluent und Säule bleiben während der gesamte Trennung konstant und Komponenten mit ähnlichen Eigenschaften können so voneinander getrennt werden. Diese Methode weist eine gute Routine auf und ist für alle Trennprobleme erstrebenswert. Leider ist dies kaum machbar. Und die meisten Fragestellungen benötigen eine Gradiententrennung.

Gradienten-Elution[Bearbeiten]

Bei dieser Trennung wird die prozentuale Zusammensetzung des Eluenten über die Zeit der Trennung verändert, d.h. die Wechselwirkungen zwischen Eluent und Säule werden kontinuierlich verstärkt. Man spricht hier von der Zumischung von organischen Modifiern. Die Komponenten der Probe werden so schneller von den theoretischen Böden der Säule verdrängt. Diese Trennung eignet sich v.a. bei Analysaten mit unterschiedlich polaren Komponenten. Sie können so in adäquater Zeit getrennt werden. Die Mischung bzw. Veränderung des Eluenten kann auf 2 Weisen geschehen. Entweder als Niederdruckgradient oder als Hochdruckgradient. Beim Niederdruckgradienten werden die Laufmittel über ein Portionierventil vor der Pumpe gemischt, also auf der Seite der HPLC-Anlage mit dem niedrigeren Druck. Eine Pumpe kann bis zu 4 Lösemittel ansaugen. Das Verweilvolumen setzt sich aus Schaltventil, Mischer, Pumpenkopf, Injektor und Kapillaren zusammen. Der Vorteil dieser Variante ist, dass man nur eine Pumpe benötigt. Die Steuerung der Zusammensetzung erfolgt über ein Klappensystem. Der Nachteil dieser Variante ist, dass die Zusammensetzung vor allem bei niedrigen Flussraten relativ schlecht reproduzierbar ist. Beim Hochdruckgradienten werden die Eluenten über separate Pumpen in eine Mischkammer geleitet, also erst auf der Druckseite der HPLC-Anlage gemischt. Das heißt aber auch, dass jeder Eluent seine eigene Pumpe benötigt. Mit dieser Variante wird das Verweilvolumen (= nur Volumen von Mischer, Injektor und Kapillaren) kleiner, d.h. der Gradient wird weniger verzögert und geglättet. So werden auch schnellere Sprünge im Mischungsverhältnis möglich. Die Trennung ist reproduzierbarer, wenn eine Hochdruckanlage verwendet wird, doch ist diese dementsprechend auch teurer.

Vorratsbehälter und Degasser[Bearbeiten]

Der Degasser wird zum Entgasen des Eluenten eingesetzt. Große Luftblasen, z.B. beim Wechseln des Vorratsbehälters, müssen über die Pumpe entfernt werden, aber kleinere kann der Degasser entfernen, sodass der Eluent nicht mit Helium oder einem Ultraschallbad entgast werden muss.
Evtl. enthaltene Gase beeinflussen die konstante Förderung und somit die Konstanthaltung des Drucks aber auch die Detektion kann durch Luft beeinflusst werden.
Im Degasser wird gelöstes Gas wird durch Anlegen eines Vakuums durch die porösen Teflonschläuche des Degassers gezogen. Des Weiteren dürfen sich auch keine Partikel oder Schwebeteilchen im Eluenten befinden. Um dies zu Verhindern werden Laufmittelansaugfilter verwendet.

Pumpen[Bearbeiten]

Also je nach Arbeitsweise transportieren eine oder mehrere Pumpen den Eluenten aus einem Vorratsbehälter zur Trennsäule. In der Regel fördern analytische HPLC-Pumpen Flüsse von 0,1 mL bis 10 mL pro Minute. Man muss sich aber dessen bewusst sein, dass 10 mL eine Menge Zeug ist. Da kann man dem Geld praktisch hinterher schauen wie es den Bach runtergeht... Die Pumpen arbeiten bei Gegendrücken von bis zu 400 bar. UHPLC-Pumpen (ultra-high-pressure-liquid-chromatography) fördern nur 0,001 - 5 mL pro Min. Dadurch wird aber ein Gegendruck von bis zu 1000 bar erreicht. In der Präparation kann man auch Fördervolumina von 200 mL/min erreichen.
Bei den Pumpen wird häufig zwischen Ein- und Doppelkolbenpumpen unterschieden.

Einkolbenpumpen: Hier schiebt eine rotierende Nockenwelle (Cam) einen Saphir- oder Keramikkolben vor- oder rückwärts. Jeder Hub verdrängt eine kleine Flüssigkeitsmenge von üblicherweise 100 µl. Die Flussregelung erfolgt über die Hubfrequenz. Durch Kugelventile kann die Flussrichtung gesteuert werden. Bei der Rückwärtsbewegung wird die untere Kugel angehoben, um den Eluenten einzulassen. Bei der Vorwärtsbewegung des Kolben wird die Kugel nach unten geschoben und verschließt so den Eluentenzulauf. Während dessen bewegt sich eine obere Kugel und lässt den Eluenten in Richtung Säule weiter.
Dieses Bewegungsschema führt aber zu einem unregelmässigen Eluentenfluss, auch Pulsation genannt. Dies beeinflusst die Säulenpackung und die Grundlinie. Daher wird ein unregelmäßig geformter Cam verwendet. Während des Füllhubs dreht er sich sehr schnell und während der Förderung eher langsam.

Doppelkolbenpumpen: Da hier 2 Pumpenköpfe phasenversetzt arbeiten, erlauben sie einen nahezu pulsationsfreien Fluss. Durch ein Einlassventil wird das Lösemittel angesaugt und dann durch einen Kolben komprimiert. Nach der Komprimierung wird es durch einen Druckmesser und das Auslassventil rausgedrückt und in Richtung Injektor befördert. Häufig werden Doppelkolbenpumpen verwendet, d.h. während der eine Kolben Lösemittel ansaugt, komprimiert der 2. Kolben den Eluenten und drückt ihn wieder raus. Dies schafft einen kontinuierlichen Fluss ohne Druckschwankungen. Je nach Trennung erreicht man im Inneren der Säule einen Druck zwischen 50 bis 350 bar. Druckschwankungen während der Messung deuten evtl. auf Verstopfungen oder Leckagen in der Apparatur hin.

Injektor[Bearbeiten]

Uber den Injektor, der sich direkt hinter der Pumpe befindet, wird die Probe in die HPLC eingeschleust. Das Problem besteht darin, die Probe von "Normaldruck" auf “Eluentendruck” zu bringen. Bei Handinjektoren ist ein 6-Wegeventil, meistens Rheodyneventil genannt, gebräuchlich. Die Probemenge (i.d.R. 10 - 50 µL) wird in eine Schlaufe eingebracht. Durch Öffnen des Ventils wird der Eluent durch die Schlaufe geleitet und die Probe zur Trennsäule transportiert.
Man unterscheidet die 2 Schritte Load und Inject. Während des Load-Vorgangs wird die Schleife mit Probe befüllt. Der Eluent wird währenddessen an der Probenschleife vorbeigeleitet. Überschüssiges Probenmaterial geht in den Abfallbehälter. Während der Injektion wird nun die Probe auf die Säule transferiert. Hierzu wird der Eluent durch die Schleife geleitet.
Bei großem Probendurchsatz lohnt sich die Anschaffung eines Autosamplers. Hier werden die Proben jeweils in einem kleinen Glasvial in ein Porbengestell eingestellt. Der Autosampler meist ein beweglicher Arm durchsticht das Septum des Vials und zieht automatisch die voreingestellte Probenmenge auf. Ein Vorteil des Autosamplers: Er arbeitet sehr viel reproduzierbarer als ein Mensch. Diese Glasspritzen sind nämlich für verdammt kleine Flüssigkeitsmengen vorgesehen. Auch der Autosampler arbeitet mit einem 6-Wege-Ventil.


Der Einfluß der Partikelgröße auf die van-Deemter-Beziehung

Trennsäule[Bearbeiten]

An der Trennsäule werden die Komponenten der Probe aufgetrennt. Sie ist das Herz der HPLC. Die Säule ist über Kapillaren mit der Probenaufgabe und dem Detektor verbunden. Hier sollte darauf geachtet werden, dass sowenig Todvolumen wie möglich erzeugt wird. Da es sonst zur Peakverbreiterung kommt. Der Mantel der Säule besteht häufig aus Edelstahl oder druckfestem Kunststoff. Um die Säule zu schützen werden häufig Fritten am Anfang angebracht. Es sind mehrere Säulentypen, je nach Fragestellung, möglich. Das verwendete Material bzw. die Modifikation bestimmt die Trennmechanismen. Andere Faktoren der Säule beeinflussen die Trennstufenzahl, den Retentionsfaktor, den Gegendruck und die Druckstabilität. Man kann zwischen partikulären (irreguläre oder sphärisch) oder monolithischen (aus einem Stück) Trennphasen unterscheiden. Am häufigsten werden partikuläre Trennphasen eingesetzt. Doch muss beachtet werden, dass irreguläre Teilchen den Gegendruck erhöhen ohne die Trennstufenzahl zu erhöhen. Monolithische Trennphasen haben Makroporen und Mesoporen. Die einen, 1 - 3 µm groß, dienen dem Transport des Eluenten, die anderen, 11 -13 nm groß, bilden eine große Wechselwirkungsoberfläche. Da hier ein geringerer Rückdruck entsteht können bei der Trennung höhere Flußraten eingesetzt werden und somit die Analysenzeiten verkürzt werden.

Auch die Größe der Partikel kann variiert werden. Normale, analytische Standard-HPLC-Säulen haben Partikeldurchmesser von 5 µm (seltener 3 µm). Die Anzahl der Trennstufen steigt mit sinkendem Partikeldurchmesser. Dafür ergeben sich aber auch deutlich höhere Gegendrücke. UHPLC-Säulen kommen mit weniger als 2 µm aus und präparative Säulen besitzen meistens Partikelgrößen von 5 - 10 µm oder gar 10 - 60 µm.
Was die Porosität angeht, kann man zwischen porös, oberflächlich porös und unporös unterscheiden. Partikel die kleiner als 2 µm sind, sind eher unporös. Oberflächlich porös sind Partikel kleiner 3 µm. Die Porosität sorgt für eine drastische Oberflächenvergrößerung.
Man sollte darauf achten, das die Säule richtig eingebaut wird. Meistens ist eine Flußrichtung angegeben, die auch der Füllrichtung entspricht.
Es gibt Gründe ab welchen es sich lohnt die Säule umzudrehen. Man sollte aber genau abwägen, was dann passieren kann. Manche Säulentypen haben z.B. unterschiedliche Fritten an Säulenanfang und Säulenende, dann sollte drauf verzichtet werden die Säule umzudrehen. Säulen mit gleichen Fritten können aber zur Regeneration umgedreht werden.

Unmodifiziertes Kieselgel. Abstand zwischen 2 OH-Grrppen ca. 0,5 nm

Säulenmaterialien:
Der Grundbestandteil von HPLC-Säulen ist in der Regel Silicagel, auch Kieselgel genannt. (Es gibt aber auch Ausnahmen). Bei der "normal Phase" wird unmodifiziertes Kieselgel verwendet.
Zu Wechselwirkungen kommt es hier vor allem durch einsame Elektronenpaare und Doppelbindungen. Die Stärke der Adsorption nimmt der Reihe nach zu: gesättigte Kohlenwasserstoffe < olefine < Aromate < Ether < Alkohole < Amide < Carbonsäuren. Es kommt zur Ausbildung von H-Brücken an den Silanolgruppen und zu vdW-Wechselwirkungen am Siloxan. Eingelagerte einfach positiv geladene Metalle verschlechtern die Trennung und führen zu Tailing. Die benachbarte Silanolgruppe wird stark sauer und interagiert vor allem mit basischen Analyten. Ein geringer Metallgehalt ist daher wünschenswert.
Wasser stört bei der Normalphasen-HPLC wesentlich mehr als bei der DC, da die Säule hier kontinuierlich umströmt wird. Als Eluenten kommen Hexan, Heptan oder MTBE (Methyl-tert-butyl-ether), also unpolare LM, in Frage.
Ein Anwendungsbeispiel wäre die Analyse der Tocopherole in Fetten.

Modifiziertes Kieselgel, In diesem Beispiel C18-modifiziert.

Bei der reversed phase (RP) wird v.a. -modifiziertes Kieselgel verwendet. Hier ist die stationäre Phase weniger polar als die mobile Phase. es kommt vor allem zu unspezifischen hydrophoben Wechselwirkungen, je nach Modifikation können die WW auch spezifisch sein. Weitere Modifikationan können mit C8 oder Phenylhexyl-Gruppen erfolgen. Um die Modifikation zu erreichen wird das Silicagel mit Monochlorsilanen umgesetzt.


So sieht dann das "end-gecappte" Kieselgel aus

Da sich in jedem nm2 ca. 5 OH-Gruppen aufhalten, kann bei diesen großen Resten nicht jede OH-Gruppen des Kieselgels reagieren. Um die Aktivität der Säule weiter zu beeinflussen kann man noch ein "end-capping" anschließen. Hier läst man die übrigen OH-Gruppen mit Trimethylchlorsilan, also relativ kleinen Molekülen, reagieren.

Die Retentionszeiten für hydrophobe Analyte verlängern sich mit Länge der Alkylkette oder je höher der Grad des end-cappings ist. Auch die Dicke der organischen Phase hat einen Einfluss auf die Retention.
C18-Säulen dienen der Trennung von hydrophoben Analyten, C8-Säulen trennen sehr stark hydrophobe Analyte. Und Phenyl-Hexyl-Säulen sind in der Aromatenanalytik weit verbreitet und eignen sich zur Auftrennung von Aromaten.
Als Eluenten dienen hier Mischungen aus Wasser und organischen Modifiern wie Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran. Die Elutionskraft der Modifier steigt der Reihe nach an: MeOH < Acetonitril < EtOH < THF.
Um zu wissen welcher Modifier für welches Trennproblem einsetzbar ist, muss man einige Tatsachen beachten. Mischt man Methanol und Wasser so kommt es zu einer starken Volumenkontraktion (= 100 mL MeOH + 100 mL H2O ergeben keine 200 mL Gesamtvolumen). MeOH ist für hohe Drücke geeignet, auch lassen sich Pufferslaze und Ionenpaarreagenzien besser in MeOH als in Acetonitril lösen.
Acetonitril ist beispielsweise eher bei niedrigen Drücke einsetzbar und teurer in der Anschaffung.
Solange es sich nicht um Spezialsäulen handelt, sollte das Elutionsmittel min. 5% organischen Modifier beinhalten, da sonst die C18-Ketten, die sich wie Bürsten ausbreiten, einfach kollabieren.

Eine Alternative zu Kieselgel (ob modifiziert oder nicht) bietet Styrol-Divinylbenzol-Polymer. Durch Copolymerisation von Styrol und Divenylbenzol können unterschiedliche Vernetzungsgrade erreicht werden. Industriell haben sich 4 oder 8% bewährt. Dieses Säulenmaterial wird vor allem bei der Größenausschlusschromatographie und in modifizierter Form bei der Ionenaustauschchromatographie eingesetzt.

Häufig werden auch noch Vorsäulen angebracht. Diese werden auf 2 unterschiedliche Arten benutzt. Zum einen gibt es Opfersäulen die vor dem Injektor platziert werden. Sie konditionieren den Eluenten indem sich ihr Inhalt teilweise löst. Der Eluent ist somit kieselgelgesättigt, wenn er an der Trennsäule ankommt. Dadurch erhöht sich die Lebensdauer der Säule. Baut man eine Vorsäule zwischen den Injektor und die Trennsäule, schützt sie ebenfalls die Trennsäule (= Schutzsäule, Guard column). Meistens besteht sie aus dem selben Material wie die Trennsäule und hält große oder polare Stoffe mit langen Retentionszeiten zurück.

Zwei Säulenmaterialien im direkten Vergleich[Bearbeiten]

Trennung von Theobromin, Theophyllin und Coffein auf einer C18(2)-Säule

Es gibt sehr viele unterscheidliche Säulen, häufig gibt es für schwierige Trennungen speziell hergestellte Trennsäulen. Hier wurde das Trennverhalten einer C18(2)-Säule (oben) und die einer Phenyl-Hexyl-Säule (unten) verglichen. Das Chromatogramm zeigt in diesem Fall eine ähnliche Peakverteilung und -form. Die kleine Spitze die man bei Theobromin sieht in der C18-Säule sieht ist nicht mehr zu sehen, aber der “Knick” in der Peakform bleibt auch bei der Phenyl-Hexyl-Säule erhalten.

Die Retentionszeiten sind im Gegensatz zur C18 -Säule etwas größer. Theobromin braucht ca. 0,8 min länger, Theophyllin ca. 0,5 min und Coffein braucht ca. 1,2 min. Auch die Peakfläche ist um ca. 10% größer.

Trennung von Theobromin, Theophyllin und Coffein auf einer Phenyl-Hexyl-Säule

Detektor[Bearbeiten]

Der Detektor registriert die Komponenten. Dies kann auf unterschiedliche Weise geschehen. Bevor wir zu den Detektoren kommen sollten wir aber noch einige Parameter ansprechen, die bei der Auswahl der Detektoren helfen:

Selektivität: Die Selektivität beschreibt die Fähigkeit unterschiedliche Substanzen nebeneinander zu bestimmen, ohne dass sie sich gegenseitig stören.

Spezifität: Beschreibt die Fähigkeit genau das zu bestimmen was gesucht ist. Ohne sich so zu sagen von anderen Komponenten ablenken zu lassen.

Empfindlichkeit: Die Empfindlichkeit wiederum wird über die Steigung der Kalibrierfunktion bestimmt. je steiler die Kurve, desto größere Änderungen treten auch bei kleinen Konzentrationsunterschieden auf. (Vgl hierzu: Kalibriergeraden)

Rauschen: Das Rauschen kann elektronischer Natur sein oder durch Pulsation des Laufmittels entstehen. Es hat erheblichen Einfluss auf die Nachweis- und die Bestimmungsgrenze. je größer das Rauschen, desto größer muss ein Peak sein der noch als solcher erkannt werden soll.
Als Nachweisgrenze wird häufig ein Signal-Rauschverhältnis von 3:1 und als Bestimmungsgrenze ein Signal-Rauschverhältnis von 9:1 verwendet.

  • UV-Detektor: Dies ist der am häufigsten eingesetzte Detektor. UV-Licht mit eingestellter Wellenlänge wird durch ein Durchflussküvette geleitet und die dahinterliegende Photodiode fängt das durchkommende Licht auf und leitet die Information als elektrisches Signal an einen Rechner weiter. Da Eluent und Probe unterschiedlich absorbieren, verändert sich das weitergeleitete Signal und diese Veränderung wird als Peak ausgegeben. Es sind verschiedene Varianten der UV-Detektoren im Einsatz: Bei Festwellendetektoren mit einer Quecksilberlampe wird die Wellenlänge durch einen Filter eingestellt. Man arbeitet i.d.R bei 254 nm da die Lampe bei dieser Wellenlänge ein sehr intensives Maximum hat. Dieser Detektor wird häufig in der Spurenanalyse eingesetzt. Variable Detektoren nutzen eine Deuteriumlampe, die durch ein optisches Gitter auf die gewünschte Wellenlänge eingestellt werden können. Photodiodenarraydetektoren sind in der Lage ein gesamtes Spektrum bzw. einen bestimmten Wellenlängenbereich und somit ein dreidimensionales Chromatogramm aufzunehmen. Das von einer Deuteriumlampe ausgesandte Licht wird von vielen Photodioden (bis zu 1024 Stück) wieder aufgefangen. Ein Gitter teilt das Licht und jede Photodiode empfängt nur eine genau definierte Wellenlänge. Diese Art von Detektor ist jedoch sehr unselektiv. Er erkennt einfach alles, was in irgend einer Weise Licht adsorbiert. Der Vorteil des DADs ist aber, dass ma evtl. noch Strukturinformationen zu der Verbindung erhält. Der Nachteil der DAD-Detektoren ist, dass sie ziemlich teuer sind.
  • Brechungsindex: Aliphatische Polymere absorbieren kein UV-Licht. Um sie zu bestimmen ermittelt man den Brechungsindex des Probe-Eluentengemisches bzw. des Eluenten selbst. Es wird eine Halogenlampe verwendet, deren Licht zum einen durch eine Probenküvette und zum anderen durch eine Küvette mit dem reinen Eluenten geleitet wird. Der Brechungsindex ändert sich, wenn die Komponenten die Säule verlassen. Diese Anderungen werden registriert und ergeben somit auch ein Chromatogramm. Diese Technik wird v.a. in der Polymerchemie, der Mineralöl- und in der Zuckerchemie verwendet. Der Nachteil des Brechungsindexes ist, dass kein Eluentengradient möglich ist. Es ist leider nicht möglich den Gradienten in der Vergleichsküvette nachzustellen. Somit reagiert der Detektor auch auf die veränderte Zusammensetzung des Eluenten. Vorteilhaft an diesem Detektor ist die universelle Einsetzbarkeit und die relativ kostengünstige Anschaffung. Nachteilig ist, das dieser Detektor vollständig unselektiv ist und eine geringe Nachweisempfindlichkeit hat. Das Rauschen kann durch Durchflussschwankungen der mobilen Phase verstärkt werden.
  • Fluoreszensdetektoren nutzen die Fähigkeit bestimmter Substanzen Licht zu emittieren aus. Eine bestimmte Wellenlänge wird eingestrahlt und regt die Komponenten der Probe zur Fluoreszens an. Spezielle Filter erkennen diese Fluoreszens und filtern sie aus dem Kontinuum. Es gibt nur wenige Substanzen, die von sich aus fluoreszieren. Man kann aber die Komponenten mit fluoreszierenden Substanzen reagieren lassen (derivatisieren) und so werden diese auch fluoreszierend. In der Regel werden Xenon-Lampen als Lichtquelle eingesetzt. Sie strahlen ein kontinuierliches Licht von 280 - 800 nm aus. Die Selektivität und die Nachweisempfindlichkeit ist unter Umständen bis zu 1000fach höher als beim UV-Detektor.
  • Elektrochemische Detektoren legen ein Potential an, worauf die zu analysierenden Stoffe oxidiert werden. Die Änderung des Potentials weist somit auf Anwesenheit der entsprechenden Komponenten hin.
  • Massenspektrometer bestehen bei der HPLC aus 3 Bestandteilen. Und zwar aus einem Interface, durch welches der Eluent eintritt und Ionen erzeugt werden, aus einem Massenanalysator und aus einem Detektor, der die Intensität des Ionenstrahls misst. Die HPLC-MS ist mit relativ wenig Aufwand zu betreiben, doch ist es eine der teuersten Analysemethoden (in der Anschaffung).


Ein Rechner kann zur Steuerung der Anlage und zum Auswerten der Daten genutzt werden. Bei modularen Anlagen gibt ein sog. Integrator das Chromatogramm aus.

Bestimmungs- und Nachweisgrenze[Bearbeiten]

Um diese Grenzen zu ermitteln zeichnet man das Hintergrundrauschen des Integrators auf. Die Attenuation wird auf 0 eingestellt, der Schreibkopf mittig postiert und der Integrator wird gestartet.

Nachweisgrenze.jpeg

Der Integrator zeigte in unserem Fall sehr starkes Rauschen. Man misst vom höchsten +Peak bis zum höhsten -Peak (bei uns 0,5cm).

Bestimmungsgrenze: Um eine Komponente quantitativ zu erfassen, muss der Komponentenpeak mindestens 10 mal größer sein als der größte Rauschpeak. Oder wie in unserem Fall 5 mal größer, weil wir die komplette Breite zur Berechnung heran gezogen haben (=2,5cm). Nun misst man eine Komponente z.B. Coffeinstandard 1:10 verdünnt. Der aufgezeichnete Peak hat eine Höhe von 4,5 cm bei einer Attenuation von 6. Eine Senkung der Attenuation um 1 bewirkt eine Verdopplung der Peakgröße. Bei einer Attenuation von 0 hätte der Peak somit eine Länge von 288cm.


288cm
2,5cm = Faktor 115,2 c(Probe) = 51,7 mg/L : Faktor 115,2 = 0,45 mg/L Die Bestimmungsgrenze liegt bei einer Konzentration von 0,45 mg/L.


Nachweisgrenze: Um eine Komponente noch qualitativ zu erfassen muss der Komponentenpeak mindestens 3 mal größer sein als der höchste Rauschpeak. Oder wie in unserem Fall 1,5 mal der Abstand 0,5 = 0,75.

288cm
0,75cm = Faktor 384 c(Probe) = 51,7 mg/L : Faktor 384 = 0,13 mg/L Die Nachweisgrenze beträgt in der Regel 30% der Bestimmungsgrenze, in unserem Fall beträgt sie 0,13mg/L

Gradientenelution[Bearbeiten]

Prinzip[Bearbeiten]

Bei unserer Anlage handelt es sich um einen Niederdruckgradienten. Es werden 2 Eluentenflaschen zur Verfügung gestellt. Acetonitril und Wasser (10:90) und reines Acetonitril werden während der Trennung unterschiedlich gemischt.

Anfangs ist der prozentuale Anteil des reinen Acetonitrils eher gering: z.B. A : B (90:10). Während der Trennung wird der Anteil des Acetonitrils erhöht, was zu einer kürzeren Retentionszeit der Komponenten führt.

Sinn des Gradienten[Bearbeiten]

Die Gradientenelution optimiert eine Trennung mit sehr unterschiedlich stark polaren Komponenten. Der große Nachteil dieser Methode ist, dass es zum sog. Drift kommt, dass heißt die Grundlinie sinkt ab oder steigt an, da der Detektor die neue Zusammensetzung erkennt zeichnet der Integrator dies auch auf.

Ergebnis[Bearbeiten]

Nachdem wir ca. 10 unterschiedliche Einstellungen probiert haben und am Ende auch kein schöneres Chromatogramm erhalten haben, haben wir es aufgegeben... Man kann zwar mit einem Eluentengradient eine Menge Zeit sparen, aber man benötigt meist auch eine lange Zeit, bis man den richtigen hat ;-)

GradientNo7.jpeg


Trouble Shouting[Bearbeiten]

Funktionieren die Mischung?[Bearbeiten]

Um die Funktion der Mischkammern zu überprüfen kann man folgendes machen: Man ersetzt die Säule gegen ein Druckstück. Anschließend fährt man einen Gradienten aus Wasser (A) und 0,5% Aceton + Wasser (B)
Das Programm sieht folgendermaßen aus:

0 min 100 % A : 0 % B
0,1 min 90 % A : 10 % B halten für 10 min
10,1 min 50 % A : 50 % B halten für 10 min
20,1 min 10 % A : 90 % B halten für 10 min
30,1 min 0 % A : 100 % B halten für 10 min

Detektiert wird bei 250 nm. Da Aceton bei dieser Wellenlänge absorbiert sollte die Grundlinie des Chromatogramms die Konzentrationsunterschiede anzeigen. Das resultierende Chromatogramm sollte also folgendermaßen aussehen:

HPLC-Acetontest.jpg

Die Zeitverschiebung von 1,5 - 2 min entspricht immer der Totzeit des Geräts und sollte bei allen Konzentrationssprüngen gleich sein. Sieht es anders aus, schwankt beispielsweise die Grundlinie oder so dann hat man ein Problem. Dann funktioniert nämlich die Mischung der Eluenten nicht mehr richtig und die erhaltenen Chromatogramme kann man in die Tonne kloppen.

LCMS[Bearbeiten]

Literatur[Bearbeiten]

  • Kromidas, S.; "HPLC für Neueinsteieger"; Novia Chormatographie- und Messverfahren GmbH
  • Metzler, M. "Chromatographische Methoden"; Vorlesungsskript
  • Meyer, V. R.; Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern; WILEY-VCH, Weinheim; 2006
  • Meyer, V. R.; Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie; WILEY-VCH, Weinheim; 2006