Gelelektrophorese

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Grundlagen[Bearbeiten]

Unter elektrophoretischen Verfahren versteht man die Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Die Geschwindigkeit mit der die Ionen wandern hängt von ihrer Größe und Ladung ab. Die Gelelektrophorese ist eine sehr nützliche Methode um Proteine oder Nukleinsäuren aufzutrennen. Proteine besitzen zum Beispiel je nach Primärstruktur und in Abhängigkeit zum pH-Wert eine positive oder negative Gesamtladung Q. In einem elektrischen Feld E, welches durch eine Potentialdifferenz U im Abstand d charakterisiert ist, wirkt auf ein Molekül mit der Ladung Q eine Kraft F.

Sobald sich ein Molekül nun zur entgegengesetzten Elektrode bewegt, entwickelt sich eine Reibungskraft (FR), die der Bewegung entgegenwirkt. Vgl Stoke'sches Gesetz

Nimmt man nun an, dass actio = reactio ist, kann man F gleich -FR setzen:

Die Wanderungsgeschwindigkeit ist also proportional zum elektrischen Feld E und umgekehrt proportional zum Radius r und zur Viskosität () der Lösung.

Da Proteine aber unterschiedlich gefaltet sind ist die Distanz die ein Ion wandert nicht proportional zur Größe des Moleküls. Diese Problematik konnte mithilfe der SDS-Pagemethode umgangen werden)

Prinzipiell kann man 3 Arten der Elektrophorese unterscheiden:

Zonenelektrophorese[Bearbeiten]

Hier beruht das Trennprinzip auf den unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld. Es entsteht eine Auftrennung der Ionen in unterschiedliche Zonen. Die Ladung der Ionen wird durch den pH-Wert des Puffers und die Temperatur beeinflusst. In der Regel werden bei dieser Art der Elektrophorese basische Puffer verwendet und die Ionen laufen in Richtung der Anode.

Isotachophorese[Bearbeiten]

Hier erfolgt die Trennung in einem diskontinuierlichen Puffersystem. Die Ionen wandern zwischen einem schnelleren Leition (i.d.R Chlorid) und einem langsameren Folgeion (i.d.R. Glycin). Das Gel ist in 2 Bereiche, das weitporige Sammelgel und das engporige Trenngel, unterteilt. Im Sammelgel werden die Ionen sozusagen vorsortiert, es besitzt einen pH-Wert von ca. 6,8. Dieser pH-Wert liegt nahe am isoelektrischen Punkt des Glycins. Daher ist das Glycin relativ langsam. Wird nun Strom angelegt, beginnen die Ionen alle mit der gleichen Geschwindigkeit an zu wandern (isotacho). Keines der Ionen kann aufgrund seiner Mobilität schneller oder langsamer wandern als die anderen, weil sich sonst eine Lücke zwischen den Ionen ergeben würde. Es entsteht ein Gradient im elektrischen Feld und die Ionen bilden einen Stapel in der Reihenfolge ihrer Mobilität (stacking Effekt). Es ergibt sich eine Regulierungsfunktion: Sollte eine Komponente in die Zone höherer Mobilität wandern, erreicht sie einen Bereich mit geringer Feldstärke und fällt sie wieder zurück. Wandert sie andersherum zu langsam kommt die Komponente in einen Bereich mit höherer Feldstärke und wird wieder beschleunigt. Die sog. Stapelung bietet den Vorteil das es zu einer Vortrennung und zu einer Aufkonzentrierung kommt.

Gehen die Ionen nun ins Trenngel über, erfahren sie eine hohe Reibungskraft und die Komponenten stauen sich auf. Dies bewirkt eine weitere Zonenschärfung. Da im Trenngel ein anderer pH-Wert vorliegt (pH 8,8) kann sich das Glycin wieder schneller bewegen und es überholt die Proteinzonen. Im Trenngel liegt nun ein homogener Puffer vor und die Proteinfraktionen können nach dem Prinzip der Zonenelektrophorese aufgetrennt werden. Hier sortieren sich die Zonen neu, da nun die Proteingröße im engeren Trenngel Einfluß auf die Mobilität gewinnt. Auch die Ladung der Proteine wird angehoben, da sich der pH-Wert erhöht hat.

Isoelektrische Fokussierung[Bearbeiten]

Hier wandern die Ionen durch einen pH-Gradienten. Es handelt sich um eine Endpunktmethode, d.h. man könnte sie kurz vor Feierabend einschalten und über Nacht laufen lassen. Gelangen die Proteine in den pH-Bereich der ihrem isoelektrischen Punkt entspricht ist die Netto-Ladung gleich null und die Proteine wandern nicht mehr weiter.

Sollte ein Protein doch noch wandern gelangt es in einen anderen pH-Bereich, erhält wieder eine Ladung und wandert wieder zurück. Es kommt also nicht zur Diffusion.

Es gibt 2 Möglichkeiten den pH-Gradienten aufzubauen:

a) Trägerampholyte

Trägerampholyte sind heterogene Gemische aus mehreren hundert unterschiedlichen niedermolekularen aliphatischen Oligoamino-Oligocarbonsäuren. Die Komponenten unterscheiden sich in ihrem isoelektrischen Punkten. Die Komponenten sollten eine hohe Pufferkapazität und hohe Löslichkeit am isoelektrischen Punkt aufweisen. Weiterhin benötigen sie eine gute und gleichmäßige Leitfähigkeit am iP, sie benötigen eine niedrige Molmasse und sollten frei von biologischen Effekten sein.

Der Vorteil von Trägerampholyten ist, dass sowohl Agarosegele als auch Polyamidgele eingesetzt werden können. Des Weiteren sind diese Gele sehr einfach herzustellen. Der Nachteil ist die herstellungsbedingte schlechte Reproduzierbarkeit. Da die Gemische sehr komplex sind, kann der pH-Gradient nicht bei jedem Gel 100%ig reproduziert werden.

b) Immobilisierte pH-Gradienten

Bei diesen Gelen werden die pH-komponenten direkt in das Gel einpolymerisiert. Es werden sog. Immobiline, die bifunktionell sind, eingesetzt. Die Immobiline sind Acrylamidderivate, die entweder schwach sauer oder schwach basisch reagieren. Man benötigt immer 2 Immobiline, anhand des sich ständig ändernden Mischungsverhältnisses, das einpolymerisiert wird, kann der pH-Gradient erzeugt werden.

Der Vorteil dieser Gele liegt in ihrer Stabilität und in den genau definierten pH-Gradienten. Der Nachteil ist, dass diese Gele schwerer herzustellen sind.

Proteinbestimmung nach Bradford[Bearbeiten]

Grundlagen[Bearbeiten]

Um eine geeignete Verdünnung der Proben herstellen zu können muss der Proteingehalt ermittelt werden. Die Proteinbestimmung nach Bradford hat sich hier bewährt. Proteine können mittels Coomassie Brillant Blau G-250 in saurer lösung eingefärbt werden und photometrisch quantifiziert werden. Die photometrische Messung beruht vorwiegend auf der Bindung des Farbstoffes an die Aminosäure Arginin, wobei die anionische Form des Farbstoffes entsteht. Durch die Bindung verschiebt sich das Absorptionsmaximum von 465 nm nach 595 nm. Die photometrische Messung erfolgte demnach bei der letztgenannten Wellenlänge. Standardmäßig wird zur Erstellung der Kalibrierkurve das Rinderserumalbumin (BSA) verwendet, wobei hier darauf zu achten ist, dass dieser Standard nicht für alle Proteinproben gleich gut geeignet ist. Die Praxis hat gezeigt, dass der Standard für Kuhmilch besser geeignet ist als für Sojamilch. Es wurden Konzentrationen von 3 - 15 L/mL als Kalibrierpunkte eingesetzt. Es wurden für jeden Standard bzw. jede Probe immer 3-fache Bestimmmungen durchgeführt. Es wurde immer eine Konzentration nach der anderen vorbereitet und bestimmt.

Bradford Reagenz: Diese Lösung sollte min. 1 Tag im Voraus hergestellt werden. 10 mg Coomassie Brillant Blau G-250 in 5 mL Ethanol lösen. 10 mL (85%ige) Phosphorsäure zugeben und mit dest. Wasser auf 100 mL auffüllen. Vor der verwendung sollte noch einmal durch einen Faltenfilter filtriert werden. Die Lösung sollte nach der Filtration bräunlich-blau sein. Haltbarkeit: Ca. 1 Woche.

Durchführung[Bearbeiten]

Je 900 L Coomassie in ein Eppi vorlegen. Nun werden 100 L Probe/Wasser in einer quantifizierbaren Konzentration (3 - 15 L/mL) zugeben. Nach einer Reaktionszeit von 5 min (im Dunkeln) kann die Extinktion bei 595 nm gemessen werden.

Als erstes sollte der Blindwert bestimmt werden, da Coomassie stark gefärbt ist. Liegt die Extinktion des Blindwertes größer als 800 nm sollten diverse Parameter geprüft werden, die den Blindwert senken können.

Herstellung der Gele[Bearbeiten]

Da wir einen vertikalen Gießstand verwendet haben wurde das Gel folgendermaßen hergestellt:

Trenngel[Bearbeiten]

Zuerst müssen alle Komponenten des Gießstandes gut entfettet werden. Anschließend wird der Gießstand zusammengebaut. Nun kann das Trenngel zusammenpipettiert werden.

Für ein 72%iges Gel werden 1,72 mL bidest. Wasser, 1,23 mL 1,5 molare TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), 1,97 mL 30%iges AA (Acrylamid), 49,2 L 10%iges SDS (Natriumdodecylsulfat), 2,46 L TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin) und 24,6 L APS (Ammoniumperoxodisulfat) mit Eppendorfpipetten zusammenpipettiert.

Ab der Zugabe von TEMED sollte alles recht zügig gehen, da das Gel beginnt auszupolymerisieren. Die kleinen Mengen sollten direkt in die Mischung einpipettiert werden und die Spitze sollte noch einmal gespült werden. Anschließend wird alles noch einmal mit einer ca. 5 mL fassenden Eppendorfpipette zügig gemischt werden. Nun kann das Gel, möglichst luftblasenfrei, in den Gießstand gefüllt werden. Am besten lässt man das Gel mit n-Butanol überschichtet und mit einem feuchten Tuch bedeckt in einem Plastiksack im Kühlschrank aufbewahrt.

Sammelgel[Bearbeiten]

Nach Absaugen des n-Butanols wird der ebenfalls entfettete Kamm in den Gießstand gesteckt. Er sollte nicht ganz so weit reingesteckt werden wie er am Ende sitzen soll. Es ist auch von Vorteil, wenn man den Kamm leicht schräg einsteckt. So kann das nachträglich draufpipettierte Sammelgel etwas besser in die Zacken laufen (luftblasenfrei). Nun kann man mit dem Zusammenpipettieren des Trenngels annfangen. Hier ist die Schnelligkeit des Arbeitens nach TEMED-Zugabe noch wichtiger.

Für ein 4%iges Gel werden 1,2 mL bidest. Wasser, 0,5 mL 0,5 molare TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), 0,25 mL 30%iges AA (Acrylamid), 20 L 10%iges SDS (Natriumdodecylsulfat), 2,0 L TEMED (N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin) und 20 L APS (Ammoniumperoxodisulfat) mit Eppendorfpipetten zusammenpipettiert.

Die kleinen Mengen sollten wieder direkt in die Mischung einpipettiert werden und die Spitze sollte noch einmal mit der Mischung gespült werden. Anschließend wird alles noch einmal mit einer ca. 5 mL fassenden Eppendorfpipette zügig gemischt werden. Nun kann das Gel in den Gießstand pipettiert werden. Anschließend wird noch der Kamm gerade in das Sammelgel gesteckt.

Anhand der großen Pipettenspitze, die im Mischungstube fallen gelassen wird, kann später überprüft werden ob die Polymerisation eingesetzt hat.

Probenvorbereitung[Bearbeiten]

In unserem Fall wurden Kuhmilch und Sojamilch analysiert. Der Proteingehalt wurde nach Bradford bestimmt und lag bei beiden Proben bei knapp 3,5%. Die Proben wurden im Vorhinein mit bidest. Wasser verdünnt und in unterschiedlichen Konzentrationen in die Taschen gefüllt. Die Endkonzentration sollte bei max. 30 g Protein / Tasche liegen. 24 werden im Endeffekt in die Taschen eingefüllt.

Färbemethoden[Bearbeiten]

Coomassie Färbung[Bearbeiten]

Das Prinzip dieser Färbung entspricht der Quantifizierung nach Bradford. Das nach elektrophoretischer Trennung erhaltene Gel wurde einer Coomassie-Färbung zur Detektion der Proteinbanden unterzogen. Die Intensität der Färbung korreliert mit der Proteinkonzentration der Banden. Die Empfindlichkeit dieses Nachweises liegt bei 100 - 500 ng pro Bande. Es wurden 5 μL des Markers und je 24 μL der Proben aufgetragen. Mithilfe des Markers (Position 1) können die Proteine anhand ihres Gewichts zugeordnet werden. Die Positionen 2 - 6 stellen eine Kuhmilchprobe in unterschiedlichen Konzentrationen dar. Die Positionen 7 bis 11 zeigen eine Sojamilchprobe in unterschiedlichen Konzentrationen.

Coomassie.jpg


Mit dem LAS3000 wurde ein Schwarzweißbild aufgenommen.

Coomassie-1.jpeg

Die Konzentrationsabhängigkeit ist bei dieser Färbung sehr schön zu sehen.

Durchführung Coomassie[Bearbeiten]

Silberfärbung[Bearbeiten]

Das Prinzip der Färbung nach Heukeshoven und Dernick beruht auf der Tatsache, dass Ag+ -Ionen mit den Aminosäuren Glutamin, Asparagin und Cystein Komplexe bilden. Dieses komplexierte Silber kann anschließend mit Formaldehyd zu elementarem Silber reduziert werden. Der Vorteil dieser Methode liegt in ihrer hohen Empfindlichkeit, die bei 5 - 30 ng Protein pro Bande liegt. Des Weiteren ist sie eine sehr kostengünstige Variante. Doch weist diese Methode sehr schwerwiegende Nachteile auf: Sie ist langwierig, schwer reproduzierbar und die Proteine können anschließend nicht weiter verwendet werden, auch eine Quantifizierung ist durch die geringe Reproduzierbarkeit nicht möglich. Des Weiteren ist die Methode nicht für Proteine spezifisch, da auch Nukleinsäuren, Lipopolysaccharide und Lipide gefärbt werden können. Es wurden 5 μL des Markers und 24 μL der Proben eingesetzt.

Silberfaerbe-handy.jpg


Literatur[Bearbeiten]

  • Lottspeich, F.; Engels, J.W. (2006)

Bioanalytik
Spektrum Akademischer Verlag, München
ISBN: 9783827415202

  • Rehm, Hubert; Letzel, Thomas (2010)

Der Experimentator ”Proteinbiochemie / Proteomics"
Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg; 6. Aufl.
ISBN: 978-3-8274-2312-2

  • Reinard, Thomas (2010)

Molekularbiologische Methoden
Eugen Ulmer Verlag, Stuttgart; 1.Aufl