Fluoreszenzspektroskopie

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Fluoreszenz / Phosphoreszenz[Bearbeiten]

Bei der UV-Vis-Spektroskopie kehren angeregte Teilchen schon nach sehr kurzer Zeit (10-12 sec) wieder in den Grundzustand zurück. Die aufgenommene Energie wird als Molekülschwingung, also als Wärme, wieder freigesetzt.
Bei eingeschränkter Bewegungsfreiheit, wie sie zum Beispiel starre Ringsysteme aufweisen, wird die Energie in Form von Strahlung wieder freigesetzt.
Bleibt die Spinsituation der Elektronen während der Absorption und Emission erhalten, also im Singulettzustand, spricht man von Fluoreszenz. Kommt es aber zu einer Spinumkehr (Triplettzustand) spricht man von Phosphoreszenz.
Zur Fluoreszenzemission kommt es auch wieder nach kurzer Zeit (10-8 sec). Die Phosphoreszenz kann sogar bis zu Sekunden andauern, da dieser Übergang eigentlich nicht erlaubt ist. Das Molekül hat nicht einfach die Möglichkeit, die Energie wieder abzugeben und den Spin wieder umzukehren. Wie lange ein Teilchen phosphoresziert ist hauptsächlich temperaturabhängig, meistens je kälter desto länger.

Aufbau[Bearbeiten]

Der Aufbau eines Fluoreszenzspektrometers ist vergleichbar mit dem Aufbau eines Photometers. Man hat eine Strahlungsquelle, einen Monochromator, eine Probenküvette, noch einen Monochromator, einen Detektor, einen Verstärker und eine Auswerteeinheit. Ein großer Unterschied ist jedoch, dass der Detektor um 90° versetzt ist, sodass er nicht die Ausgangsstrahlung mit erfasst.

Auswertung[Bearbeiten]

Die emittierte Strahlung ist gegenüber der absorbierten Strahlung längerwellig verschoben. Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung (If) kann über folgende Formel berechnet werden:

If = I0 * 2,3 *  * c * d * Q

Wobei:
I0 = Intensität des eingestrahlten Lichts
= molare Extoinktionskoeffizient der absorbierenden Substanz
c = molare Konzentration der Lösung (sollte ziemlich gering sein)
d = Lichtweg in cm
Q = Quantenausbeute, d.h.

Das erhaltene Spektrum ist abhängig von der Anregungswellenlänge.

Quantenausbeute[Bearbeiten]

Auch diese Spektroskopieform sollte in ausreichend verdünnten Lösungen durchgeführt werden, da es ansonsten zu einer Senkung der Quantenausbeute kommt:

  • teilweise Reabsorption (v.a. der kurzwelligen Anteile der Emission)
  • Dimerisierung
  • Bildung von Excimeren

Ein Excimer bezeichnet ein angeregtes Dimer (excited dimer). Es ist ein Dimer von Molekülen, die sich nur zusammenlagern, wenn eines der beiden Monomere schon angeregt ist. Excimere trennen sich wieder sobald das Monomer die Energie wieder verliert. Es zeigt sich bei der Excimerbildung eine weitere, breite Bande im Spektrum bei höheren Wellenlängen. Ist die Lösung ausreichend verdünnt, sieht man nur eine Bande des Monomers. Hat man also mehr Banden als man gebrauchen kann, sollte man eine andere Verdünnung wählen.

Hauptfehler[Bearbeiten]

  • Wie schon oft erwähnt: Zu hohe Konzentrationen
  • Fluoreszenzlöschung durch Quencher (aus dem Lösemittel oder aus der Matrix). Die Quencher übernehmen die Energie der Analytmoleküle und geben diese strahlungslos wieder ab.
  • Einschleppung fluoreszierender Moleküle aus den Detergenzien, Hahnenfett, Filterpapieren oder der Matrix.

Daher ist sauberes und kritisches Arbeiten absolut notwendig!

Anwendungsbeispiele[Bearbeiten]

Es lassen sich natürlich, zu aller erst mal fluoreszierende Moleküle (wie PAKs, Aflatoxine, Vitamin B1 und B2 etc) nachweisen. Das schöne ist aber, dass sich auch nichtfluoreszierende Moleküle durch Fluoreszenzmarkierung nachweisen lassen. Sogenannte Fluoreszenzsonden sind beispielsweise 4-Methylumbelliferon, Fluorescein oder auch Ethidiumbromid.
Eine zunehmend wichtige Rolle spielt die Messung der Fluoreszenz mittlerweile auch bei den Immunoassays. Hier wird mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gearbeitet.

Luminometrie[Bearbeiten]

Hier kommt es zur Lichtabgabe ohne vorherige Anregung mit elektromagnetischer Strahlung. Die benötigte Energie wird entweder chemisch oder enzymatisch bereit gestellt. Je nach dem welche der oben genannten Varianten angewendet wird spricht man von Chemo- oder Biolumineszenz.

Als Beispiel: Reagiert Luminol sowohl mit Wasserstoffperoxid/OH- also auch mit Wasserstoffperoxid/Peroxidase unter Lumineszenzbildung. Das erste Mal ist es eine Chemolumineszenz, das zweite mal eine Biolumineszenz.

Da hier die Energie aus der Reaktion an sich kommt weist ein Luminometer weder eine Strahlungsquelle noch einen Monochromator auf. Da enzymatische Reaktionen aber sehr temperaturabhängig sind, hat es eine Temperiereinheit.