Enzyme

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Enzyme[Bearbeiten]

Praktisch alle chemischen Reaktionen in der Zelle laufen enzymkatalysiert ab, d.h. Enzyme (auch Biokatalysatoren genannt) beschleunigen den Ablauf bestimmter chemischer Reaktionen, ohne dass sie selbst dabei verbraucht werden oder die Gleichgewichtslage beeinflussen.
Zu Beginn des 19. Jahrhunderts wurde die biologische Katalyse wohl das erste Mal beschrieben. Louis Pasteur kam Mitte des 19.Jahrhundert dann zu der Erkenntnis, dass die alkoholische Gärung durch Fermente katalysiert wird. Zur Beginn des 20. Jahrhunderts stellt Buchner fest, dass diese Wirkung von Fermenten nicht an die Mikroorganismen (Hefen) gebunden ist.
1926 konnte dann erstmals Urease isoliert und auskristallisiert werden. Seitdem sind Enzyme als Proteine charakterisiert.

Ein Beispiel[Bearbeiten]

Glutaminsäure kann nicht direkt in Glutamin umgewandelt werden. Doch durch die Zufuhr von freier Energie gelingt dem Körper diese Reaktion trotzdem. Das Enzym Glutaminsynthetase kann diese benötigte freie Energie zusammen mit einem Phosphatrest (aus ATP) auf die Glutaminsäure übertragen. Anschließend "hält" sie das Glutaminphosphat fest und sorgt für die richtige Orientierung, damit das fehlende Ammoniumion addiert werden kann.

Enzyme in Lebensmitteln[Bearbeiten]

Auch in Lebensmitteln haben Enzyme weiterreichende Eigenschaften. Erwünschte Enzymreaktionen wären z.B. Reifung oder Fermentation, sowie unerwünschte Reaktionen wie Verderbsreaktionen. Auch Gewinnung bzw. Entfernung diverser Inhaltsstoffe sind möglich (z.B. Spaltung von Laktose für laktosefreie Produkte)

Bindung des Substrats[Bearbeiten]

Katalytisch wirksam sind nur einige funktionelle Gruppen des Enzyms. Diese befinden sich im sog. "aktiven Zentrum". Dieses kann kurzfristig mit einem Substrat wechselwirken und es so umsetzen. Die benötigte Energie stammt aus schwachen nicht kovalenten Wechselwirkungen.
Die sog. Substratbindungsenergie ist die Hauptquelle für die freie Enthalpie, die zur Herabsetzung der Aktivierungsenergie benötigt wird.
In der Regel kommt es nach der Substratbindung an das aktive Zentrum zu einer Konformationsänderung.
Es gibt 2 mögliche Modelle, wie man sich die Bindung eines Substrats an das aktive Zentrum vorstellt:

  • Schlüssel-Schloß-Prinzip: Bei diesem Prinzip ist das Enzym genau zum Substrat passend. Wie ein Schlüssel der nur genau in ein Schloss passt. Dieses Modell wurde 1894 von Emil Fischer vorgestellt.

oder:

  • Indukted-Fit-Modell: Hier geht man davon aus, dass sich das Enzym dem Substrat anpasst und seine Form leicht verändert. Dies ist ein neueres Modell und entspricht wohl eher der Realität. Vor allem, wenn man davon ausgeht, das manche Enzyme weniger substratspezifisch sind als andere.
Inducted-Fit-Model.png


Enzyme sind substrat- bzw. wirkungsspezifisch. Diese Spezifität ist durch das aktive Zentrum bestimmt. Durch Enzyme können Reaktionen auch unter physiologischen Bedingungen ablaufen, auch wenn theoretisch mehr Energie benötigt werden würde. In der Biochemie kommt es zur Zusammenfassung von Reaktionen zu Reaktionswegen.

Meist sind die Enzyme nicht einzeln anzutreffen. So sind beispielsweise die Enzyme der Glycolyse in sogenannten Multienzymkomplexen zusammengefasst. Dies ermöglicht eine schnelle Weiterreaktion der Substrate ohne zusätzliche Transportwege bzw -mechanismen.

Häufig wird auch das imaginäre Stabase-Enzym, welches in der Lage ist Eisenstäbe zu brechen, als Beispiel angeführt. Es veranschaulicht das Inducted-fit Modell eigentlich sehr gut.
1) Um diesen Stab zu brechen muss er erst einmal verborgen werden. (Dies entspricht also dem Übergangszustand) Hierfür benötigt man eine Aktivierungsenergie G*.
2) Das aktive Zentrum dieses Stabasemoleküls entspricht einer von magnetengesäumten Tasche. Anfangs ist das Enzym sehr eng an diesem Metallstab anliegend, sodass niemals die benötigte Energie zu dessen Verformung aufgebracht werden kann.
3) Sobald die oben genannten Wechselwirkungen ihre volle Kraft entfalten kommt es zur Verformung des Enzyms und es entsteht ein Hohlraum. In diesem Hohlraum kann nun der Stab gebogen werden.

Dies erklärt auch, warum Enzyme häufig so groß sind. Die Größe ist abhängig davon, wie viele schwache WW für die Umsetzung benötigt werden.

Aktivierungsenergie[Bearbeiten]

Die Aktivierungsenergie stellt eine energetische Barriere für chemische Reaktionen dar. Ohne sie würden Makromoleküle spontan in einfachere Moleküle zerfallen. Und die hoch geordneten Strukturen der Zelle einfach zusammenbrechen. Absenkung der Aktivierungsenergie durch Bindung der an der Reaktion beteiligten Moleküle im Übergangszustand:

Absenkung-Aktiener.png

Man könnte die Eigenschaften von Enzymen auch so beschreiben: Sie öffnen einen alternativen Reaktionsweg mit niedrigerer Barriere.

Enzymklassen[Bearbeiten]

  • Klasse 1 Oxidoreduktasen
  • Klasse 2 Transferasen (Gruppenübertragungsreaktionen)
    • Kinasen (Phosphorylierung)
  • Klasse 3 Hydrolasen
  • Klasse 4 Lyasen (hizufügen oder entfernen von Gruppen, mit Doppelbindungsbildung)
  • Klasse 5 Isomerasen (meist intramolekulare Gruppenübertragung)
  • Klasse 6 Ligasen (2 Substrate werden unter ATP-Verbrauch zu einem Produkt)

Cofaktoren[Bearbeiten]

Ein Enzym mit einem Cofaktor wird Holoenzym genannt, ohne Cofaktor ist es ein Apoenzym. Als Beispiele seien Coenzym A, Biotin, Tetrahydrofolat, Zink- und Magnesium-Ionen genannt.

Sind die Cofaktoren organische Moleküle sind es Coenzyme. Sind die Cofaktoren fest an das Apoenzym gebunden sind es prosthetische Gruppen (z.B. FAD). Sind sie nur vorübergehend gebunden nennt man sie Co-Substrate (z.B. NADH)

Enzym-cofaktor.jpg

Weitere Möglichkeiten um die Aktivität von Enzymen zu beeinflussen sind Phosphorylierungen, Glycosylierungen und andere Modifikationen. (Enzymregulation)

Natürlich können auch Metallionen als Cofaktoren dienen:

  • Fe2+ in Cytochrom-Oxidasen (Atmungskette)
  • Cu2+ ebenfalls Cytochrom-Oxidasen
  • Zn2+ in der Alkoholdeydrogenase (ADH)
  • K+ in der Pyruvat-Kinase (Citratzyklus)

...

Enzymkinetik[Bearbeiten]

Die Menten-Kinetik legt folgenden Reaktionsmechanismus zugrunde:

E + S ES-Komplex EP-Komplex E + P

Die Enzymkinetik folgt der Michaelis-Menten-Gleichung. Die Geschwindigkeit steigt (ohne Sättigung) linear mit steigender Edukt-Konzentration an. Ab einer gewissen Konzentration erreicht die enzymatische Reaktion ein Maximum und kann nicht weiter gesteigert werden.

vmax entspricht der Geschwindigkeit bei der alle aktive Zentren besetzt sind. Aus der Maximalgeschwindigkeit ergibt sich die sog. Wechselzahl. Die Wechselzahl zeigt an, wie viele Substratmoleküle pro Sekunde ins Produkt umgewandelt werden (i.d.R zwischen 1 und 104 mol/(L*s)).
Die Geschwindigkeit ergibt sich aus: v =

Menton-kurve.jpg

KM ist also die Konzentration an Substrat bei der die Hälfte von vmax erreicht wird. Sie ist ein Maß für die Affinität des Substrates zum Enzym. Je kleiner KM, desto größer die Affinität (i.d.R. zwischen 10-1 bis 10-7 mol/L). Dieser Wert ist abhängig vom Substrat, pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke.

Um KM für eine Reaktion zu bestimmen, misst man vAnfang bei diversen Konzentrationen und trägt und nach Lineweaver-Burk gegeneinander auf. Dabei erhält man eine Gerade deren y-Achsenabschnitt gerade ist und der x-Achsenabschnitt entspricht .

Lineweaver-Burk-Kinetik.jpg

Die Auftragung nach Lineweaver-Burk ist eines der am häufigsten verwendeten Linearisierungsverfahren. Sie hat Vor- und Nachteile.
Ein Vorteil ist, dass die Lineweaver-Burk-Darstellung die Variablen v und [S], genauso wie bei der Michaelis-Menten-Kinetik, getrennt voneinander aufgetragen werden. Dadurch sind Abweichung von der Menten-Kinetik gut erkennbar und hemmende Mechanismen (vgl. Inhibitoren) lassen sich gut beurteilen. Der Nachteil an Lineweaver-Burk ist die unterschiedliche Fehlerfortpflanzung entlang der Konzentration.

Eine weitere Konstante ist kkat, dies ist eine katalytische Konstante. kkat wird über v = bestimmt. Dies setzt aber die Kenntnis der molaren Menge des eingesetztes Enzyms voraus.

Das Verhältnis wird als katalytische Effizienz bezeichnet. Der Wert gilt als Maß für die Substratspezifität des Enzyms. Je höher der Wert desto höher die Spezifität.

Bei einer Auftragung nach Eadie-Hofstee wird v über aufgetragen. Eine Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung ergibt folgende Gleichung:

v = -KM  + vmax

Der erhaltene y-Achsenabschnitt entspricht vmax und KM entspricht der negativen Steigung der Geraden.

Maßeinheiten der Enzymaktivität[Bearbeiten]

  • Unit (U) = Enzymmenge die ein Micromol Substrat pro Minute umsetzt (unter definierten Bedingungen).
  • Katal (Kat) = Enzymmenge, die 1 Mol Substrat pro Sekunde umsetzt (unter definierten Bedingungen).

In der Praxis hat sich eher die Unit bewährt.

  • Die spezifische Enzymaktivität wird in der Regel auf die Proteinmenge (U/mg) oder das Volumen (U/mL) bezogen.
  • Bei Kenntnis des Molekulargewichts kann die molare Aktivität (U/mol) angegeben werden. Sind außerdem noch die Anzahl der aktiven Zentren pro Enzymmolekül bekannt, kann die Wechselzahl angegeben werden.

Abhängigkeit der Aktivität[Bearbeiten]

  • Substrat und dessen Konzentration
  • pH-Wert des Reaktionsgemisches
  • Temperatur (Enzym-Kits sollten beispielsweise nicht direkt aus dem Kühlschrank verwendet werden.)
  • Cosubstanz
  • Ionenmillieu des Reaktionsgemisches

pH-Optimum[Bearbeiten]

Je nachdem wo die Enzyme arbeiten, haben sie unterschiedliche pH-Optima. So hat Pepsin, das im Magen anzutreffen ist, ein pH-Optimum von ungefähr 2. Trypsin, dass die Verdauung unterstützt und somit im Darm arbeitet, hat ein Optimum von ungefähr 8. Dies liegt an der pH-abhängigen Veränderung in der Proteinstruktur und im Ladungszustand des aktiven Zentrums.

Enzym-pH-Wert.jpg


Um das pH-Optimum eines Enzyms zu bestimmen, setzt man das Reaktionsgemisch mit unterschiedlichen Puffersystemen an.

Aber nicht nur der pH-Wert bestimmt die Aktivität, auch die Ionen aus denen sich der Puffer zusammensetzt spielen eine Rolle.

Beispiele für pH-Optima[Bearbeiten]

Nach pH geordnet:

  • Pepsin pH 2
  • -Fructofuranosidase (Invertase) pH 4,5
  • Lipase pH 5-8
  • -Amylase pH 5,2
  • Lipoxigenase Typ IIa pH 6,5
  • -Gucosidase (Maltase) pH 6,6
  • Papain pH 7-8
  • Chymotrypsin pH 7,8
  • Lipoxigenase Typ Ia pH 9,0
  • Pektinlyase pH 9,0 - 9,2

Einfluß der Temperatur[Bearbeiten]

Ähnlich wie bei Mikroorganismen spielt auch bei den Enzymen die Temperaur eine große Rolle. Da es sich bei Enzymen auch um Proteine handelt denaturieren sie ab einer gewissen Temperatur und verlieren dadurch sowohl ihre Struktur als auch ihre Funktionalität.
Die Inaktivierung von Enzymen wird häufig als Erhitzungsnachweis eingesetzt, z.B. wird die Inaktivierung von Peroxidase als Nachweis einer erfolgreichen Blanchierung von Tiefkühlgemüse genutzt.

Enzyminhibitoren[Bearbeiten]

  • Bindet der Inhibitor reversibel ans aktive Zentrum, wird dies kompetetive Inhibition genannt.
  • Bindet der Inhibitor irreversibel ans aktive Zentrum, wird dies nichtkompetetive Inhibition genannt (meist kovalente Bindung). Auch Vergiftungen, z.B. durch Schwermetalle, sind nichtkompetetive Hemmungen


Die Abbildungen zeigen den Einfluß der verschiedenen Inhibitoren auf die Enzymkinetik:


Menton-kurve.jpg

"float left" "float left"



Bei einer kompetetiven Hemmung erreicht das System die gleiche maximale Geschwindigkeit, wie ohne Hemmung. Doch man benötigt eine höhere Substratkonzentration.

Bei einer nichtkompetetiven Hemmung erreicht das System eine geringere vmax. Auch wenn das Substrat in sehr hohen Konzentrationen dazugegeben wird.

Die Auftragungen nach Lineweaver-Burk verändert die Kurvenform folgendermaßen:


Lineweaver-Burk-Kinetik.jpg

"float left" "float left"

Bei einem kompetetiven Inhibitor zeigt sich keine Veränderung der maximal Geschwindigkeit. KM scheint sich zu erhöhen.

Bei einem nichtkompetetiven Inhibitor verringert sich vmax, aber KM scheint sich nicht zu verändern.

Als Beispiel für eine kompetetive Hemmung sei die Hemmung der Alkoholdehydrogenase-katalysierten Oxidation von Methanol durch Ethanol genannt.

Und ein Beispiel für eine nichtkompetetive Hemmung: Hemmung der Acetylcholinesterase durch bestimmt Organophosphate (Bsp: Paraoxon).

Die nichtkompetetive Hemmung wird häufig zur Aufklärung des aktiven Zentrums eingesetzt.

Allosterische Enzyme[Bearbeiten]

Diese Enzyme weisen meist 2 unterschiedliche Bindestellen auf. Das aktive Zentrum und eine 2. Bindestelle. Diese 2. Bindestelle ermöglicht eine Steuerung der Enzymaktivität. Sie kann entweder durch ein Substratmolekül besetzt werden oder aber durch ein "aktivierendes" (anderes) Molekül. Wie auch immer sobald diese 2. Bindestelle besetzt ist, verändert sich die Konformation des allosterischen Enzyms und das aktive Zentrum wird "freigelegt", also aktiviert oder aber auch blockiert. Vgl Abb:

Allost-enzym-schematisch.jpg

Die allosterische Enzymkinetik sieht etwas anders aus, als die der "normalen" Enzyme. Sie folgt der Hill-Gleichung. Der Kurvenverlauf ist sigmoidal (sigmoidal wie s-förmig!!!)

v =  (mit h = Hill-Koeffizient, K0,5 = Substratkonzentration bei 50%iger Sättigung)
Kinetik-Allosterisch.jpg

Sequenzielle Verdrängung[Bearbeiten]

Geordnet[Bearbeiten]

Beispiel:

Pyruvat + NADH + H+  Lactat + NAD+

Geordnet spielt hier auf die Reihenfolge der Bindung im Enzym an: Erst bindet das NADH und dann das Pyruvat, das Lactat wird als erstes vom Enzym freigegeben gefolgt vom NAD+.

Nach Cleland würde die Reaktion folgendermaßen aussehen:

E(NADH)(Pyruvat)  E(Lactat)(NAD+)

Zufällig[Bearbeiten]

Beispiel:

Kreatin + ATP  Kreatinphosphat + ADP

Hier ist es relativ Wurst welche der Substrate zuerst am Enzym bindet und welches Produkt das Enzym als erstes verlässt. Die Reaktion startet auch in diesem Beispiel erst, wenn alles da ist.

Cleland beschreibt die Reaktion dann folgendermaßen:

E(Kreatin)   E(Kreatinphosphat)
 (ATP)           (ADP)

Doppelte Verdrängung[Bearbeiten]

Die doppelte Verdrängung wird auch Ping-Pong-Reaktion genannt. Es werden schon ein oder mehrere Produkte schon freigesetzt bevor überhaupt alle Substrate gebunden haben:


Aspartat     Oxalacetat     -Ketoglutarat     Glutamat
                                               
E_________________________________________________________________________E


Nach Cleland würde die Reaktionsgleichung folgendermaßen aussehen:

E(Aspartat)  (E-NH3)   (E-NH3)  (E-NH3)           E(Glutamat)
                (Oxalat)                (-Ketoglutarat)