Enzymatische Methoden

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Grundlagen[Bearbeiten]

Enzymatische Methoden können auf 2 Arten betrieben werden. Einerseits können bestimmte Substanzen (v.a. viele unterschiedliche Zuckerarten) enzymatisch bestimmt, also quantifiziert werden. Andererseits können durch die Ermittlung der Enzymaktivität Erhitzungsnachweise geliefert werden (z.B. bei Milch).
Enzymatische Methoden sind häufig an die Reaktion von Coenzymen gekoppelt. Häufig werden die Coenzame NAD+/NADH bzw. NADP+/NADPH verwendet. Da die reduzierte Formen (NADH/NADPH) im UV-Spektrum ein zweites Meximum bei 340 nm zeigt, kann die Umstzung von der einen in die andere Form photometrisch bestimmt werden. Die Umsetzung des Coenzyms ist äquivalent zur umgesetzten Substratmenge, die erlaubt eine Quantifizierung. Es spielt hierbei keine Rolle, ob die reduzierte Form entsteht oder abgebaut wird.

Absorption-NADH.jpg

Anwendungsbeispiele[Bearbeiten]

Da bei enzymatischen Bestimmungen eine hohe Empfindlichkeit und eine hohe Spezifität gegeben ist und diese Bestimmungen sehr schnell durchgeführt werden können werden sie häufig in der Lebensmittelanalytik eingesetzt. Von besonderer Bedeutung ist die Quantifizierung der Kohlenhydrate, org. Säuren oder auch Cholesterin.
Bei einer Analyse der Enzymaktivität können Rückschlüsse auf den Frischegrad oder auf evtl. Behandlungen gezogen werden.

Arbeitsschritte[Bearbeiten]

Probevorbereitung[Bearbeiten]

Aufgrund der Spezifität der Enzyme ist eine Isolation des Analyten meist nicht notwendig. Teilweise müssen störende Komponenten wie Eiweiß oder ähnliches entfernt werden, da diese die Absorption stören. Häufig wird eine Carrez-Klärung oder eine Extraktion angewandt.

Messung[Bearbeiten]

Die Umsetzung der Probe mithilfe der Enzyme erfolgt in der Regel direkt in der Küvette (Schichtdicke d = 1 cm). Es werden nach und nach Pufferlösungen, Enzymlösungen usw. zugesetzt und mit einem Pümpel (= Rührspatel) gemischt. Nach einer angemessenen Reaktionszeit erfolgt die Messung der Extinktion bei 340 nm. Es wird vor und nach Enzymzugabe gemessen. Der Extinktionskoeffizient von NADH bzw. NADPH ist für die Auswertung ausschlaggebend.
Die Extinktionen sollten den Bereich von 0,1 - 1,0 nicht verlassen.

Arbeitsschema[Bearbeiten]

Grundsätzlich wird zusätzlich zu den Proben auch ein Blindwert angesetzt. Dieser ermittelt die Eigenabsorption der verwendeten Substanzen.
Zuerst wird der Puffer und das Coenzym in einer Küvette vorgelgt und mit bidest. Wasser auf ein bestimmtes Volumen aufgefüllt. (Es muss nicht immer bidest. Wasser sein, meist reicht normales destilliertes Wasser. Dies kommt aber immer auf die Art der Analyse an!). Bei der Probe wird je nach Konzentration entweder nur Probenflüssigkeit eingesetzt oder nur ein Aliquot welches auch mit Wasser auf das benötigte Volumen aufgefüllt wird.
Nun wird die Extinktion der Lösung gemessen. Dies ist sozusagen der Ausgangswert.
Nun wird die Reaktion durch Zugabe des Enzyms gestartet. Ist die Reaktion vollständig abgelaufen wird die Extinktion erneut gemessen. E ist ein Maß für die Zu- oder Abnahme des NADH-Menge.
Je größer die Konzentration des Analyten, desto länger auch die Reaktionszeiten. Bei höher konzentrierten Lösungen ist es daher sinnvoll, zu prüfen ob die Reaktion tatsächlich vollständig abgelaufen ist. Hierfür wird einfach 5 min nach der in der Anleitung angegebenen Messung erneut die Extinktion des Leerwertes und der Probe bestimmt. Wird eine Extinktionsänderung registriert,muss geklärt werden ob es sich hierbei um die Hauptreaktion handelt oder um sogenannte Schleichreaktionen. Bei der Hauptreaktion nimmt die Extinktinsänderung mit der Zeit ab, da ja der Analyt verbraucht wird. Bei Schleichreaktionen ist die Extinktionsänderung pro Zeiteinheit konstant. Durch mehrfaches messen der Extinktion alle 2 min kann also nun geklärt werden um welche Reaktion es sich handelt.

Auswertung[Bearbeiten]

Da es sich hierbei um eine photometrische Bestimmung handelt, gilt mal wieder das Lambert Beer'sche Gesetz. Es ist an dieser Stelle unnötig die genauen Berechnungen aufzuführen diese können den jeweiligen Enzym-Kits entnommen werden.


Prinzip einzelner Bestimmungen[Bearbeiten]

Hier ist das eine oder andere Beispiel einer enzymatischen Bestimmung.

D-Glucose/D-Fructose[Bearbeiten]

Bei dieser Bestimmung werden sowohl Glucose als auch Fructose durch das Enzym Hexokinase unter ATP-Verbrauch phosphoryliert, also in G-6-P und F-6-P umgewandelt.
Das Enzym Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase wandelt G-6-P in Anwesenheit von NADP+ in D-Gluconat-6-phosphat und NADPH um. Die Menge des gebildeten NADPHs ist der umgesetzten Glucosemenge äquivalent. Hier wird nun zum 2. mal die Extinktion gemessen. Anschließend wird F-6-P durch Phosphoglucose-Isomerase in G-6-P umgewandelt. Dieses reagiert wiederum mit NADP+ und G-6-P-Dehydrogenase zu D-Gluconat-6-phosphat. Auch hier ist die gebildete Menge an NADPH der Menge an umgesetzter Furctose äquivalent. Nach Ablauf der Reaktion wird die Extinktion ein weiteres Mal bestimmt. Wie die einzelnen Extinktionen nun genau verrechnet werden entnimmt man bitte dem Beipackzettel des Enzym-Kits.

Cholesterin[Bearbeiten]

Die Bestimmung von Cholsterin kann auch über ein Enzym-Kit erfolgen. Es wird hier aber nicht die Menge an NAD+ oder NADH bestimmt.

Das Cholesterin der Probe wird mittels Cholesterin-Oxidase zu Cholesteron oxidiert.
Cholesterin + O2 4 − Cholesteron + H2O2
Das bei der Reaktion entstehende Wasserstoffperoxid oxidiert Methanol in Gegenwart von Katalase zu Formaldehyd.
MeOH + H2O2 HCHO + 2 H2O
Formaldehyd bildet mit Acetylaceton in Gegenwart von NH4+-Ionen einen gelben Lutidin-Farbstoff.
HCHO + NH4+ + 2Ethylaceton Lutidinfarbstoff + 3 H2O
Die Menge des entstandenen Lutidinfarbstoffes ist der Menge an Cholesterin äquivalent. Die Messung erfolgt bei 405 nm.

Fehlerquellen[Bearbeiten]

  • Alte Enzym-Kits
  • Reaktionsgemisch ist zu kalt. Da Enzym-Kits in der Regel im Kühlschrank aufbewahrt werden müssen sie vor Analysenbeginn auf Raumtemperatur gebracht werden.
  • Zu hohe oder zu geringe Konzentrationen der Probe. Das Lambert Beer'sche Gesetz ist nur in einem bestimmten Konzentrationsbereich gültig!
  • Zu kurze Reaktionszeiten
  • Fehler bei der Extraktion. Matrixkomponenten wie beispielsweise Eiweiß stören die photometrische Messung.
  • Pipettierfehler. Gerade für Anfänger scheinen die einzelnen Pipettierschritte manchmal etwas verwirrend zu sein. Es kann leicht passieren, das man eine Komonente vergisst oder das falsche Volumen pipettiert.
  • Rechenfehler. Auch hier kann es manchmal zu Verwirrung kommen.
  • Photometer zu spät eingeschaltet. Es braucht ein bißchen Zeit um sich warmzulaufen.
  • Orientierung der Küvetten nicht berücksichtigt. Vor allem bei Einmalküvetten gibt es meist eine klare und eine trübe Seite. Die eine ist für die Messung die andere eignet sich hervorragend um die Küvetten anzufassen.
  • Rührspatel? Ob man es glaubt oder nicht. Es soll schon vorgekommen sein, das der eine oder andere den Spatel hat steckenlassen ;-)