Dünnschichtchromatographie

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Bei der Planarchromatographie wird ein planares Trennmedium eingesetzt. Da die Papierchromatographie heute kaum noch eingesetzt wird, ist die DÜnnschichtchromatographie die wichtigste planarchromatographische Methode.

Dünnschichtchromatographie[Bearbeiten]

Die Dünnschichtchromatographie wird angewendet um Stoffgemische aufzutrennen. Sie wird häufig als Screeningverfahren eingesetzt.
Bei der DC wird ein flächiges quadratisches Trennbett verwendet (meistens mit dem Maßen 10x10 oder 20x20cm). Auf ein Aluminium- oder Glasträger wird Kieselgel, Aluminiumoxid oder Cellulose (je nach Trennproblem) in einer dünnen Schicht aufgebracht. Mittels kleinen Kapillaren können dann kleine Probentröpfchen an speziellen Punkten der Platte aufgebracht werden. Stellt man diese Platte nun hochkant in ein Laufmittel wird dieses durch Kapillarkräfte angesaugt und zieht die Probenkomponenten mit sich. Man muss darauf achten, dass sich die Spots oberhalb des Flüssigkeitspegels befinden. Oder anders herum, dass das Laufmittel nicht zu hoch in die Entwicklungskammer eingefüllt wird.
Eine Besonderheit der Dünnschichtchromatographie ist wie schon erwähnt, dass die mobile Phase durch Kapillarkräfte bewegt wird. Die Laufmittelfront hat keine konstante Geschwindigkeit. Ein weiterer Unterschied zu anderen Chromatographiearten ist, dass die Analytmoleküle das chromatographische System nicht verlassen. Daher wird anstelle der Retentionszeiten ein Retentionsfaktor (rF-Wert) ermittelt. Um eine Substanz eindeutig zu charakterisieren wird eine Referenzprobe analysiert.
Häufig sieht das dann so aus, dass man auf 3 Spots unterschiedliche Konzentrationen der Probe aufträgt und auf den verbleibenden Spots daneben Referenzproben aufträgt. Anhand des Retentionsfaktors und der Färbung kann eine genaue Zuordnung erfolgen. Um das Ergebnis 100%ig zu sichern fertigt man häufig noch ein zweites Chromatogramm, ein sog. Mischchromatogramm an. Hier wird der Probe etwas der vermuteten Referenzprobe zugesetzt. Handelt es sich um dieselbe Substanz zeigt sich im Chromatogramm nun ein etwas größerer Fleck, als vorher. Sollte es wider Erwarten doch etwas anderes sein, dann zeigen sich 2 Spots. Weiter unten sind ein paar Beispiele.
Der rF-Wert ermittelt sich aus dem Quotient der Laufweite der Substanz und der Laufmittelfront. Bei der Entwicklung einer DC mit einer 10x10 cm Platte lässt man das Lösemittel maximal bis 9,5 cm laufen. Die Auswertung wie weit die Substanzen von der Startlinie gelaufen sind und daraus das Verhältnis mit der Laufmittelfront kann mit einem Lineal erfolgen.
Für die Trennung bei der Dünnschichtchromatographie sind vor allem Adsorption und Verteilung verantwortlich. Da die Trennmedien (sowohl mobile als auch stationäre Phase) nur einmal verwendet werden, sind Rückstände von Wasser eher unrelevant. Bei der Adsorption handelt es sich nicht um irreversible chemische Adsorption sondern um van-der-Waals-Kräfte und Wasserstoffbrücken.

Stationäre Phasen[Bearbeiten]

Wie schon erwähnt handelt es sich meist um Glas-, Kunststoff- oder Aluminiumträger auf denen die stationäre Phase fixiert ist. Es wird eine flüssige Suspension hergestellt und aufgesprüht. Man kann diese Platten auch selber herstellen, sie sind jedoch nicht so schön gleichmäßig, wie industriell gefertigte. Je nachdem ob es sich um eine analytische Trennung oder eine präparative Trennung handelt variieren die Schichtdicken zwischen 0,1 - 0,25 mm oder 0,5 - 2 mm.
Bei einer normalen DC werden Korngrößen zw. 10 - 40 µm verwendet bei der etwas feineren HPTLC (=high performance thin layer chromatography)werden Korngrößen von 3 - 10 µm verwendet.
HPTLC-Platten haben eine höhere Trennstfenzahl und angeblich kürzere Trennzeiten. Das halte ich aber für ein Gerücht. Wir haben in der Uni mal normale DC-Platten und anschließend HPTLC-Platten verwendet. Die HPTLC-Platten haben locker doppelt solange gebraucht.
Es ergibt sich eine Öberfläche von 400 bis 600 m2 pro g.
Natürlich werden die Phasen nicht nur zur Auftrennung verwendet. Durch Fluoreszenzindikatoren (z.B. Mangan-aktiviertes Zinksilikat), die in die Schichten integriert sind, kann man farblose Substanzen durch Fluoreszenzlöschung / -minderung bei der entsprechenden Wellenlänge detektiren. Mangan-aktiviertes Zinksilikat fluoresziert beispielsweise bei 254 nm.
Eine weitere Variante ist noch das Integrieren einer Konzentrierungszone. Dies ist eine Zone aus großporigem inerten Material mit der die Analytmoleküle fokussiert werden können. Dadurch lässt sich mehr Probe auftragen ohne das die Spots übermässig groß werden. Die Trennung kann durch eine Konzentrierungszone schärfer werden.
Die Substanzen können zu guter letzt noch mithilfe von Färbereagenzien eingefärbt werden.

Kieselgel: wird für 80% aller DC Applikationen verwendet. Die Anhaftung der Substanzen erfolgt über Wasserstoffbrücken an den Silanolgruppen (Si-OH) oder durch van-der-Waals-Kräfte am Sauerstoff der Siloxangruppe (Si-O-Si)
je nach Verhältnis zwischen Siloxan- und Silanolgruppe kommt es zur Aktivierung oder Inaktivierung der Platten. Die Platte können beispielsweise durch Trocknung bei ca. 130°C aktiviert werden. Je aktiver sie sind, desto stärker die Wechselwirkungen und desto stärker werden die Substanzen festgehalten. Durch Bildung von mehr Siloxangruppen wird das Gel inaktiver (Bildung erfolgt bei Temperaturen > 200°C). Bei der Herstellung der Platten wird darauf geachtet, dass die Temperatur unterhalb von 200°C bleibt.
Weitere Materialien wären:
Aluminiumoxid: das in der Regel als Al2O3 vorliegt. Bei den Wechselwirkungen handelt es sich meistens um Adsorption. Durch Wasseran- oder -einlagerung ist aber auch Verteilung möglich. Die Adsorption erfolgt über lewis-saure Zentren des Aluminiumoxids.
Polymamide: binden spezifisch Phenole, Enole, Nitroverbindungen, Dicarbonsäuren, aromatische Carbonsäuren und saure synthetische Farbstoffe. Alkalische Lösemittel oder Lösemittel die starke H-Brücken ausbilden können (z.B. MeOH) führen zu Desorption.

Cellulose: nimmt Wasser auf und immobilisiert dieses. Hier kommt es eher zu einer Verteilung des Analyten als zu einer Adsorption. Celluloseplatten werden überweigend für die Trennung von hydrophilen Substanzen, also Aminosäuren, Kohlenhydrate und Phosphate eingesetzt.

So wie in der HPLC werden auch zunehmend bei der Dünnschichtchromatographie Umkehrphasen eingesetzt.

Laufmittel[Bearbeiten]

Das Fließ- oder auch Laufmittel hat die Aufgabe die Analytmoleküle weiter zu transportieren. Es entwickelt sich ein Konkurrenz an den Adsorptionsstellen. sowohl Laufmittel als auch Analytmoleküle wollen dort binden.
Anhand der Elutionswirkung kann man die unterschiedlichen Laufmittel in einer elutropen Reihe anordnen. Diese folgt im Wesentlichen der Polarität der Lösemittel. Lösemittel mit einer hohen Elutionskraft werden besser von der stationären Phase adsorbiert. Daher werden relativ polare Analytmoleküle mit relativ unpolaren Lösemitteln getrennt. Der Überschuß des Laufmittels begrenzt die Anzahl der aktiven Zentren.
Je polarar die Probe, desto höher muss auch die Elutionskraft des Laufmittels sein.
Um für ein bisher nicht beschriebenes Trennproblem das richtige Laufmittel zu finden kann man das Stahlsche Dreieck verwenden. Die zeigt je nach Polarität des Analyten die benötigte Polarität des Laufmittels und die Aktivität der verwendeten DC-Platte an. Man kann zu anfang natürlich auch mal einen Spot-Test ansetzen. Dabei werden mehrere Spots des Analyten auf die DC-Platte aufgetragen und mit Tropfen unterschiedlicher Laufmittel versetzt. Je nachdem wie die Spots nun auseinander fließen (oder auch nicht) kann man nun das beste Laufmittel auswählen.
Wird ein zusammengesetztes Laufmittel aus mehreren Komponenten verwendet, kann es auch passieren, dass die stationäre Phase das Laufmittel auftrennt, das heißt man kann 2 Laufmittelfronten sehen.

Probenaufgabe[Bearbeiten]

Die Probenaufgabe erfolgt bei der DC mit Hilfe von Mikropipetten, Glaskapillaren oder aber auch vollautomatisch. Die Probe sollte so aufgebracht werden, dass noch Platz nach unten ist und die Probe nicht im Laufmittel steht. Auch sollte zwischen den Spots ausreichend Platz zur Verfügung stehen, damit sich die unterschiedlichen Substanzen nicht vermischen.
Die Auftragung erfolgt strich- oder punktförmig. Es ist sehr wichtig, dass die Probenspots trocknen bevor die Platte entwickelt wird! Muss man relativ viel Probe auftragen (ca. 5 µL) dann sollte immer etwas ausgetragen werden und anschließend mit dem Fön getrocknet werden. Dann wieder ein bißchen auftragen und trocknen. Solange bis die 5 µL aufgetragen wurden und trocken sind. Man sollte immer darauf achten, die Spots so klein wie möglich zu halten, dann ist auch der Spot später so klein wie möglich. Das Probevolumen sollte bei der DC bei 1 - 5 µL und bei der HPTLC bei 0,1 - 0,5 µL liegen. Natürlich richtet sich dies auch nach der Konzentration der Probe. Wenn nur geringe Konzentrationen vorliegen muss man eben mehr auftragen und mehr fönen. Die Menge sollte zwischen 1 - 10 µg Substanz liegen.

DC-Platte in einer Entwicklungskammer

Wenn man nicht genau weiß, wie viel in der Probe enthalten ist, wird man zunächst 3 unterschiedliche Probenmengen auf die 3 Plätze ganz links auftragen. Die restlichen Spots kann man dann für Vergleichssubstanzen verwenden.

Entwicklung[Bearbeiten]

Um eine DC-Platte zu entwickeln wird sie in eine vorbereitete Entwicklungskammer, sog. N-Kammer (normal), eingestellt. Die Kammer kann, um eine bessere Sättigung zu erhalten, mit Filterpapier ausgekleidet werden. (Dies erschwert es jedoch ein bißchen zu sehen ob die Entwicklung schon fertig ist oder nicht.) Dann füllt man das Laufmittel ein, indem man es über das Filterpapier gießt. Hat man die Kammer eine halbe Stunde geschlossen stehen lassen, sollte sie gesättigt sein und der Luftraum mit Lösemittel geflutet sein.
Nun kann die mit Proben bestückte Platte vorsichtig eingestellt und entwickelt werden. Bei der Entwicklung muss man unbedingt darauf achten, dass die Laufmittelfront immer min. einen halben cm unterhalb der oberen Kante bleibt. Da man sonst die Auswertung anhand der rF-Werte vergessen kann. Die laufmittelfront muss mit Bleistift eingezeichnet werden! Sonst ist sie weg, wenn das Lösemittel getrocknet ist.
Es handelt sich häufig um eine aufsteigende Entwicklung. Das Laufmittel wandert aufgrund von Kapillarkräften nach oben.
Bei manchen Trennproblem kann eine zweite Entwicklung entweder mit dem gleichen Laufmittel oder mit einem anderen sinnvoll sein. Es ist auch eine 2 dimensionale Entwicklung möglich. Es können da natürlich nicht alle Spots verwendet werden. Nach der ersten Entwicklung wird die Platte um 90° gedreht und erneut mit einem anderen Laufmittel entwickelt. So können auch Spots getrennt werden die nach der ersten Entwicklung noch übereinander lagen. Dies wird häufiger bei Antioxidantien angewendet.
Aufgrund von Verteilungsprozessen zwischen der stationären und der mobilen Phase kann es sein, dass die Reproduzierbarkeit von der Kammersättigung abhängig ist oder durch eine Konditionierung der Platte beeinflusst werden kann.
Mittlerweile werden auch vollautomatische System angeboten, bei denen die Vorkonditionierung, die Entwicklung und die Trocknung der Platte per Computer gesteuert wird.
Auch horizontale Entwicklung ist möglich. Das Laufmittel erreicht über einen Kapillarspalt die Platte. So kann eine Platte auch von 2 Seiten gleichzeitig entwickelt werden und dadurch die Anzahl der Spots auf der Platte verdoppelt werden. Dies gelingt jedoch nur, wenn entweder die Platte groß genug ist, oder aber die Substanzen in einer kurzen Strecke adäquat von einander getrennt werden können.
Auch eine sogenannte Gradientenelution ist möglich. Hierbei werden verschieden Laufmittel mit abnehmender Polarität eingesetzt. Bei jedem Lauf wird die Laufstrecke etwas erhöht. So kann eine optimale Trennung der unterschiedlichsten Analyten erfolgen.
Für die Papierchromatographie werden meistens große runde Entwicklungskammern verwendet. Das "Papier" wird einmal zusammengerollt und anschließend an den Ecken zusammengetackert. Das sieht zwar etwas instabil aus funktioniert aber ganz gut. Und das wichtigste ist, dass die Proben nicht übereinander oder aneinander kleben.

Detektion[Bearbeiten]

Die Detektion erfolgt entweder über die Eigenfärbung der Analyten oder mithilfe von Derivatisierungen.
Vor allem bei Farbstoffen wird die Eigenfärbung der Analyten genutzt. Es gibt aber auch andere Möglichkeiten. Aflatoxine sind fluoreszierende Analyte. Andere Analyte absorbieren UV-Licht bei 254 oder 366 nm. Wie schon erwähnt können auch die DC-Platten an sich fluoreszierend sein und die anufgetragenen Analyte quenchen das Signal.
Zucker können durch das Besprühen oder Betupfen mit einer Färbelösung derivatisiert werden. Andere Analytmoleküle können mittels Tauchbad sichtbar gemacht werden.
Die Derivatisierungsreagenzien sind entweder selektiv oder unselektiv. Schwefelsäure ist beispielsweise unselektiv und weist alle organischen Substanzen nach.


Quantifizierung[Bearbeiten]

Abgesehen davon, dass man halbquantitative Aussagen machen kann (vgl. Chromatogramme unten) können auch richtig quantitative Aussagen gemacht werden.
Die Verwendung eines Densitometers erlaubt die Quantifizierung von UV-aktiven und sichtbaren Substanzen sowie die Quantifizierung von fluoreszierenden Verbindungen. Ein Desitometer ist ein Spektralphotometer mit einer Transportvorrichtung für die DC-Platte. Die Oberfläche wird mit monochromatischem Licht bestrahlt. Der Lichtstrahl wird aufgeteilt. Eine Hälfte "tastet" den Analyten ab, die andere Hälfte bildet den Referenzstrahl. Die Messung kann im Durchstrahlverfahren verwendet werden, wenn es sich um Glasplatten handelt. Es kann aber auch im Reflexionsmodus (Remissionsmessung) gemessen werden. Hier wird die Tatsache ausgenutzt, dass es bei der substanzfreien Oberfläche zur fast vollständigen Reflektion des Lichts kommt. Der Analytfleck absobiert jedoch Licht in Abhängigkeit zur Konzentration.

Anwendung[Bearbeiten]

P = Probe in drei unterschiedlichen Konzentrationen, G = Glucose, S = Saccharose, L = Lactose, F = Fructose, M = Mannose, R = Raffinose

Ein häufiger Anwendungsfall ist beispielsweise die Analyse von Zucker. Um sich einen Überblick zu verschaffen, welche Zuckerarten in der Probe enthalten sind kann man Vergleichslösungen mit Glucose, Fructose, Mannose und Saccharose ansetzen und jeweils eine davon auf die verbliebenen Plätze auftragen. Nach der Entwicklung ist ein direkter Vergleich der Probenspots mit denen der Vergleichslösungen möglich. Die Rammnose kommt leider auf dem Photo nicht so gut zur Geltung. Im Labor wars schön zu sehen.

Mischchromatogramm P = Probe, G = Glucose, F = Fructose

Im ersten Bild sieht man den Effekt der unterschiedlichen Konzentrationen ziemlich gut. Der Vergleich der rF-Werte der Probe mit denen der Reinsubstanzen legt den Verdacht nahe, dass sich in der Probe Glucose und Fructose befinden.
Dieser Verdacht wird nun mit einem Mischchromatogramm entweder bestätigt oder verworfen. In dem hier gezeigten Beispiel kann man eindeutig nachweisen, dass die Probe sowohl Glucose als auch Fructose enthält. Würde die Probe etwas anderes enthalten, müsste man bei den Mischungen der Probe + Glucose bzw. Probe + Fructose 3 Flecken sehen. Die Färbung ist ebenfalls noch zur Identifizierung dienlich. Aufgrund von Matrixeffekten kann es dazu kommen, dass die Spots "nach unten gezogen werden". Das heißt sie wandern nich so weit wie die Spots der Reinsubstanzen.
Die Färbung erlaubt dann evtl. noch eine Zuordnung.

Gleichzeitig erstelltes Chromatogramm: Zuckeralkohole, P = Probe, So = Sorbit, Ma = Mannit, G = Glucose, F = Fructose

Nachdem die Zucker detektiert wurden, wurde ein zweites Chromatogramm für die Zuckeralkohole gefertigt. Hier kann man gleich mehrere Sachen sehen. Einerseits war ich bei der Probenaufgabe etwas ungestüm und habe die Platte beschädigt. Man sieht dies an den kleinen metallischen Punkten auf der Startlinie. Hier fehlt die stationäre Phase komplett. ;-)
Andererseits sieht man auch das die Auswertung etwas schwierig werden kann. Auch wenn hier die Platte schön eingefärbt ist, kann man leider nicht 100%ig sagen, ob sich Mannit in der Probe befindet. Sorbit kann ausgeschlossen werden, denn die Mischung aus Probe und Sorbit hat einen zusätzlichen Fleck. Doch Mannit liegt so nahe an Glucose und Fructose, dass man nicht garantieren kann dass es drin ist.


Konkrete Arbeitsabläufe[Bearbeiten]

Papierchromatographie[Bearbeiten]

Funktioniert wie die DC wird aber auf Filterpapier gemacht.