Chromatographische Grundlagen

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Mobile und stationäre Phasen[Bearbeiten]

Bei der Chromatographie handelt es sich um eine physikalisch-chemische Trennmethoden. die Substanzen können aufgrund unterschiedlicher Verteilungen zwischen einer stationären und einer mobilen Phase aufgetrennt werden. Man kann mehrere verschiedene Chromatographiearten unterscheiden: HPLC Dünnschichtchromatographie oder Gaschromatographie.
Grundsätzlich bewegt sich eine "mobile" Phase über eine feststehende "stationäre" phase hinweg und bewegt die Analytmoleküle in unterschiedlichem Umfang mit sich.
Diese Chromatographiearten unterscheiden sich anhand ihrer Phasen, sowohl der stationären als auch der mobilen Phase.
So setzen Flüssigchromatographiearten wie HPLC und DC auf flüssige, mobile Phasen und die Gaschromatographie auf gasförmige mobile Phasen.
Aber auch die stationären Phasen können sowohl fest als auch flüssig vorliegen. Man spricht dann von flüssig-fest oder flüssig-flüssig oder von gas-fest oder gas-flüssig-Chromatographie.
Ein weiterer Unterschied ist die geometrische Form der stationären Phase. Bei HPLC und Gaschromatographie liegt die stationäre Phase in Form von gepackten oder Kapillarsäulen vor. Diese werden mit der mobilen Phase durchströmt/durchspült, wobei sich relativ große Drücke aufbauen können. Bei der Dünnschicht- oder Papierchromatographie handelt es sich um ebene Flächen, die häufig hochkant in einer mobilen Phase stehen. Aufgrund der Absorptionskräfte wird die mobile Phase nun nach oben gezogen. Also aufgesaugt.

Bewegung[Bearbeiten]

Es können ziemlich viel Kräfte an der Bewegung der Analytmoleküle beteiligt sein. Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch oder -ausschluss, aber auch Gelpermeation oder Bioaffinität trennen die Moleküle auf.


Begrifflichkeiten[Bearbeiten]

Die Analytmoleküle gehen unterschiedliche Wechselwirkungen mit der stationären Phase ein. Sie haben somit unterschiedliche Verweilzeiten, sog. Retentionszeiten. Die Retentionszeit beschreibt die Zeit, die ein Molekül braucht um einmal den gesamten Aufbau zudurchwandern. Substanzen die keine Wechselwirkung mit der stationären Phase eingehen, werden also je nach Geschwindigkeit der mobilen Phase direkt nach Durchlaufen der Apparatur wieder hinten rausgeschmissen. Sie werden als nicht-retardierende Substanzen bezeichnet.
Die Elution bezeichnet das durchströmen der mobilen Phase durch die stationäre Phase. Bis auf bei der DC wird die mobile Phase solange fließen, bis die einzelnen aufgetrennten Analytmoleküle hinten am Detektor wieder ankommen.

Beispiel Curcuminlösung HPLC UV-Detektion: Jeder Peak entspricht hier einer Substanz, die sich in der Lösung befunden hat.

Der Verlauf der Elution wird als Chromatogramm also als Linie dargestellt. Verschiedene Detektoren können den Gehalt an Analytmolekülen ermitteln und graphisch in Form eines Peaks ausgeben. Je nach Detektor ist die Peakfläche als auch die Peakhöhe der Substanzmenge proportional.

Peakformen[Bearbeiten]

Idealerweise sehen die Peak symmetrisch aus. Die ideale Gauß-Verteilung, da ja statistisch gesehen alle Analytmoleküle der gleichen Art mehr oder weniger die gleichen Wechslewikrungen mit der stationären Phase eingehen. Ist aber eine Säule nicht unbedingt für ein Analytmolekül geeignet können sich die merkwürdigsten Peakformen ergeben. Es gibt aber auch noch andere Phänomene die eine Verbreiterung des Peaks, das heißt einen zeitlichen Versatz der Elution, mit sichbringen:
Eddy-Diffusion
Die stationären Phasen sind in der Regel porös, d.h. die Moleküle können beim Durchwandern der stationären Phase unterschiedliche Wege einschlagen. Die einen etwas kürzer die anderen etwas länger.
Strömungsverteilung
Die mobile Phase ist eine laminare Strömung, das heißt sie fließt in Schichten, die sich nicht untereinander vermischen. Da sie durch die stationäre Phase hindurchfliesst ist die Strömung in der Mitte zwischen 2 Körnern der stationären Phase schneller, als in unmittelbarer Nähe zu den Körnchen.
Bewegung des Analyten in der mobilen Phase
Da sich die Analytmoleküle innerhalb der mobilen Phase bewegen/diffundieren kann auch dies zu einer Peakverbreiterung führen.
Last but not least fehlt noch der Stoffaustausch
Da das Material der stationären Phase sehr porös ist bilden sich Taschen aus, in denen das Elutionsmittel stagnieren kann. Wie eine kleine geschützte Bucht. Gelangt nun ein Analytmolekül in so eine Tasche ist die Aufenthaltszeit innerhalb der Säule etwas länger als die der anderen Moleküle. Die bewegen sich ja mit der mobilen Phase weiter.
Man kann also davon ausgehen, dass die Verbreiterung eines Peaks grundsätzlich eine Funktion des Säulenmaterials und der Strömungsgeschwindigkeit des Eluenten (=mobile Phase) ist.

Theoretische Böden[Bearbeiten]

Je nach Trennproblem hat eine Trennsäule unterschiedliche Böden, auch Trennstufen genannt. Will man ein Gemisch aus Substanzen trennen sollten diese Substanzen unterschiedliche Verteilungskoeffizienten aufweisen. Will heißen die Substanz A sollte eine größere Affinität zur mobilen Phase haben und die Substanz B eine höhere Affinität zur stationären Phase.
Aufgrund der unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten haben die Substanzen A und B unterschiedliche Retentionsfaktoren. Die Substanz A wandert relativ schnell mit der mobilen Phase ohne große Wechselwirkungen einzugehen. Die Substanz B wird sich eher an die stationäre Phase anlagern. Strömt nun im Laufe der Trennung frisches Laufmittel ein stellt sich ein neues Gleichgewicht ein. Hier ist kein B vorhanden also löst sich ein Teil B von der Säule und wandert etwas weiter um sich wieder an einer unbesetzten Position der Säule abzusetzen. Und so rutscht die Substanz B nach und nach an der Säule entlang. Die Ablösung und Anheftung ist eine Funktion des Verteilungskoeffizienten und erlaubt so eine Trennung der unterschiedlichen Substanzen. Weisen A und B einen gleichen Verteilungskoeffizienten auf lassen sie sich auch nicht trennen.
Je nachdem wie viele dieser theoretischen Böden eine Säule hat, desto besser verläuft die Trennung. Je mehr theoretische Böden, desto kleiner ist auch die Trennstufenhöhe. Da sie auch von der Fließgeschwindigkeit abhängt, kann man mithilfe der van-Deemter-Kurve die optimale Trennung ermitteln.

Van-Deemter[Bearbeiten]

Abgesehen von den Parametern (= stationäre und mobile Phase, Probenvolumen und Temperatur) beeinflussen noch andere Prozesse die Trennung. Sie sind von der Fließgeschwindigkeit des Eluenten abhängig und werden in der van-Deemter-Gleichung zusammengefasst.

Van-Deemter Beziehung

Die Eddy-Diffusion A beschreibt die Verbreiterung der Probenzone durch mechanische Widerstände die die Säule der mobilen Phase und den Probekomponenten entgegensetzt. Die einzelnen Komponenten bewegen sich auf unterschiedlichen Wegen durch die Säule, was alleine schon zu unterschiedlichen Austrittszeiten aus der Säule führt. Dieses Phänomen bewirkt eine Peakverbreiterung. A ist unabhängig von u.

Die Diffusion B beschreibt die Teilchenbewegung, die infolge des Konzentrationsgefälles auftreten. Durch eine hohe Fließgeschwindigkeit wird dieser Einfluss minimiert, da er zeitabhängig ist.

Der Stoffaustausch C beschreibt nun die eigentliche chromatographische Trennung. Die Zahl und die Intensität der Wechselwirkungen der Komponenten mit der stationären Phase wirkt sich auf die Retentionszeiten aus, sodass eine vollständige Peaktrennung erreicht werden kann. Aber die Faktoren A und B wirken dieser Trennung entgegen, da sie eine Rückvermischung bewirken. Der Stoffaustausch benötigt eine gewisse Zeit, sodass geringe Fließgeschwindigkeiten zu einer besseren Trennung führen. Dies bewirkt aber eine größere Diffusion.

Die achwarze Kurve zeigt die Höhe H der theoretischen Böden, die blaue Gerade entspricht dem Stoffaustausch C, die grüne Gerade entspricht der Eddy-Diffusion A und die rote Kurve der Diffusion B. Die daraus resultierende H(u)-Funktion zeigt ein Minimum bei einer bestimmten Fließgeschwindigkeit u der mobilen Phase. In diesem Minimum ist die Höhe der theoretischen Böden am kleinsten, d.h. die Anzahl der Böden ist dort am größten. Im Minimum ist die Stärke der Trennung am größten, d.h. auch das die Peaks schmaler werden.

Aus dem Chromatogramm ableitbare Faktoren[Bearbeiten]

Da die Retentionszeit von der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase abhängt, ist es günstiger den Retentionsfaktor k zu bestimmen.

(wobei der Totzeit entspricht)

Die Totzeit wird uber eine nicht retardierende Substanz, wie beispielsweise Uracil, bestimmt. Der Retentionsfaktor ist nur indirekt von der Säulenlänge und der Fließgeschwindigkeit abhängig. Retentionsfaktoren zwischen 1 und 10 sind optimal.

Ist k<1 ist die Trennung evtl. ungenügend. Je größer k ist, desto länger dauert die Analyse.

2 Komponenten werden nur dann sauber getrennt, wenn sich ihre k-Werte bzw. ihre Retentionszeiten deutlich von einander unterscheiden.

Als Maß für eine saubere Trennung zieht man den Trennfaktor heran, er zeigt somit die Selektivität der Trennung an.

Ist = 1 gibt es keine Trennung. Eine Änderung der mobilen bzw. der stationären Phase bewirkt eine Änderung des Trennfaktors.


Ein weiteres Kriterium zur Beurteilung der Trennung ist die Auslösung R.

ist die Breite des Peaks auf halber Höhe. Der Integrator unserer HPLC-Anlage (ne ziemlich alte Kiste, die man schnell lieb gewinnt) gibt eine WIDTH aus, durch den Korrekturfaktor 0,94 erhält man aus der Width die .

Ist R=1 ist eine vollständige Trennung zweier Peaks nicht gegeben. Man kann evtl. 2 Spitzen erkennen, doch quantifizieren lassen sie sich nicht.

Für eine Quantifizierung ist eine Basislinientrennung notwendig, d.h. R≈1,5. Des weiteren kann man die Anzahl der theoretischen Böden N, also die Andockmöglichkeiten an der stationären Phase, ermitteln.

Streng genommen gilt diese Formel nur f¨r absolut Gaus-f¨rmige Peaks, die aber eine Seltenheit sind.

Aus der Säulenlänge L und der Bodenzahl N ergibt sich die Bodenhöhe H.

H ist also die Strecke auf der sich einmal ein Gleichgewicht einstellt.