Ames-Test

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Allgemein[Bearbeiten]

Der Ames-Test ist ein relativ kostengünstiger und einfach durchzuführender Test, der die Genotoxizität von Substanzen nachweist. Es werden mutierte Salmonella typhimurium Stämme verwendet. Die Mutation betrifft nur ein Gen und zeigt sich durch den Verlust der Fähigkeit Histidin zu synthetisieren. Die Stämme sind also Histidin-auxotroph (heißt so viel wie "auf Histidin von außen angewiesen").
Wenn nun diese Salmonellen mit einer genotoxischen Substanz in Berührung kommen, kommt es bei der Inkubation zu einer Rückwärtsmutation (Mutation Wildtyp) und die Keime sind nun wieder in der Lage Histidin zu synthetisieren.

Bei der Mutation handelt es sich je nach Stamm entweder um eine Basenpaarsubstitution oder um eine Rasterleseverschiebung.

Was das genau heißt zeigt das Beispiel: (Da es so verwirrend ist mit nur 4 Buchstaben (C,G,T und A evtl. noch U) hab ich einen Satz genommen)

Wildtyp:  BOB GAB IHM EIN EIS MIT

Basenpaarsubstitution: BOB GAB IHR EIN EIS MIT

Leserastermutation: BOB MGA BIH MEI SMI T

Wird die Mutation durch eine genotoxische Substanz rückgängig gemacht werden die Salmonellen wieder Histidin -protroph.

Der Ames-Test erlaubt nicht nur eine Erkennug der Mutagenität sondern erlaubt eine Aussage über die Art der Mutation. Es können auf diese Art jedoch nur direkt mutagenwirkende Substanzen gezeigt werden, da diese Bakterien keine Cytochrome haben. (Salmonellen haben nur die Glutathion-S-Transferase und die N-Acetyltransferase) Manche Substanzen sind aber erst nach einer metabolischen Aktivierung mutagen. Um auch die Metabolite erfassen zu können wird dem Versuchsansatz ein mischfunktionelles Cytochrom P-450-System hinzugegeben, welches die potentiell mutagene Substanz nun auch metabolisieren kann. Am häufigsten wird der sog. S9-Mix verwendet. Der S9-Mix besteht aus Lebermikrosomen die ein Cytochrom P-450-System und ein NADPH generierendes System enthalten.

Durchführung und Versuchsaufbau[Bearbeiten]

Grundsätzlich reicht es nicht aus einfach mal schnell die Mikroorganismen mit der Testsubstanz zu vermischen und dann auf einem Histidinfreien Agar anzuzüchten! Es ist wirklich wichtig, das ein Test aus mindestens 3 Proben aufgebaut ist.
Nämlich einer Blindprobe, einer Positivprobe und einer Probe mit der Testsubstanz.

Die Salmonellen werden in flüssigem Nährboden mit der Testsubstanz und dem S9-Mix inkubiert (je nach Fragestellung mehrere Stunden). Anschließend wird dieses Gemisch auf einer Platte mit einem Histidinfreien Agar ausgegossen und 2 Tage bei 37°C bebrütet.
Bei der Blindprobe wird genauso vorgegangen, nur das man hier die potentiell genotoxische Testsubstanz weglässt.
Zu guter Letzt noch eine Positivkontrolle angesetzt, d.h. eine Bakterienprobe wird mit einem bekannten Kanzerogen versetzt und wie oben beschrieben inkubiert, ausgegossen und bebrütet.

Auswertung[Bearbeiten]

Da Salmonellen Histidin zur Vermehrung benötigen, sollte die Blindprobe keinen Koloniewachtum zeigen. Aber man kann ja nie wissen, vielleicht stimmt mit den Viechern was nicht. Die eine oder andere Kolonie kann immer mal wachsen, es kann auch bei Salmonellen mal zu Spontanmutationen kommen. Man muss aber wissen wie viele es sind, um die Probe mit der Testsubstanz auswerten zu können.
Bei der Positivkontrolle wird ja ein bekanntes Kanzerogen zugesetzt, also sollte hier auf jeden Fall Koloniewachstum zu sehen sein. Wenn man hier keine Kolonien findet, dann stimmt auf jeden Fall was mit den Kulturen nicht. Vielleicht wurden sie zu lange oder falsch gelagert.
So. Wenn nun bisher alles nach Plan verlief und die Kultur in Ordnung ist fehlt nur noch die Auswertung der Probe. Der aufmerksame Leser wird es wissen. Wächst was? Dann ist die zu testende Substanz genotoxisch. Wächst nichts? Dann ist sie es nicht. Wenn sich vereinzelt, ganz wenige Kolonien zeigen muss man das mit dem Blindwert vergleichen. Es kann sich dann auch hier um spontane Mutationen handeln.


Vor- und Nachteile[Bearbeiten]

Vorteile[Bearbeiten]

  • kostengünstig
  • einfache Durchführung durch nicht-pathogene Keime und einfachem Versuchsaufbau
  • "relativ" zügige Ergebnisse (vgl HPRT-Test)
  • sehr empfindlich für viele Substanzen

Nachteile[Bearbeiten]

  • Es muss ein exogenes Metabolisierendes System hinzugefügt werden
  • erfasst nur Substanzen die Genmutationen hervorrufen

Verfeinerungen[Bearbeiten]

Mittlerweile gibt es relativ viele unterschiedliche dieser mutierten Salmonellen-Stämme. Je nach Fragestellung hat man verschiedene zur Auswahl:

  • DNA-Reparatursystem wurde ausgeschaltet. Die DNA ist empfindlicher gegen Angriffe.
  • Einführung einer besonders fehlerhaften SOS-Reparatursystems.
  • Zellen mit einer leicht geschädigten Zellwand. Leicht genug, damit die Dinger überleben aber stark genug, dass die Testsubstanz leichter hindurchdiffundieren kann. Dies führt auch zu einem Verlust der Pathogenität (= krankheitsauslösende Wirkung). So kann man mit diesen Teststämmen auch ohne besonderes Labor einfach hantieren.